廖 帥，鄭曉梅，丁華強(qiáng)，汪棋笙，張 燁，何濟(jì)民，李祥龍，陳禮剛，江 涌，劉 亮

作者單位：646000瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科[廖 帥（醫(yī)學(xué)碩士研究生）、丁華強(qiáng)、張 燁、何濟(jì)民、李祥龍、陳禮剛、江 涌、劉 亮]，神經(jīng)內(nèi)科（鄭曉梅）；646200合江，合江縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科（汪棋笙）

0 引 言

顱腦創(chuàng)傷是一種常見的外傷性疾病，發(fā)病率逐年增加且致死率致殘率均據(jù)外傷性疾病之首［1-4］。鈣調(diào)蛋白是存在于真核細(xì)胞中一種與鈣離子（Ca2+）結(jié)合的受體蛋白，可介導(dǎo)調(diào)控多種病理生理過程。顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞Ca2+超載是顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)性腦損傷的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)，大量?jī)?nèi)流的Ca2+與高度表達(dá)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后介導(dǎo)并調(diào)控一系列神經(jīng)細(xì)胞損傷［5-6］。而亞低溫治療是已被國(guó)內(nèi)外廣泛接受的腦保護(hù)措施，可減輕顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用［7-8］。本研究旨在探討亞低溫對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后鈣調(diào)蛋白表達(dá)的影響并探討其保護(hù)機(jī)制，觀察對(duì)腦水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取90只成年健康SD大鼠，雌雄不限，體重270～300 g，均來自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（川）2013-181，標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)。該研究符合動(dòng)物倫理原則。隨機(jī)分為常溫組（37℃，擊打制作顱腦創(chuàng)傷模型）、亞低溫組［（32±0.5）℃，擊打制作顱腦創(chuàng)傷模型］，假手術(shù)組（37℃，僅開骨窗，不擊打），每組30只。各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CCI顱腦創(chuàng)傷儀（美國(guó) PSI），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（北京TaKa-Ra），兔抗鼠Anti-Calmodulin、兔抗鼠Anti-GAPDH抗體和山羊抗兔IgG H&L HRP（英國(guó)abcam），蛋白Marker（美國(guó) Thermo Fisher），SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、0.2 μm PVDF膜、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物），Loading Buffer、脫脂奶粉、山羊血清（北京索萊寶科技）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量30 mg/kg。麻醉后剪去頭部術(shù)區(qū)毛發(fā)，將大鼠以俯臥位置于立體定向儀，皮膚消毒，沿中線剪開皮膚，暴露顱骨并剖離骨膜，于顱骨中線右方2.5 mm，冠狀縫后2.5 mm處用顱鉆開一直徑約5 mm骨窗，暴露硬腦膜并保持完整。使用CCI顱腦創(chuàng)傷儀擊打，擊打深度為2.5 mm，速度4.5 m/s，接觸時(shí)間100 ms。擊打后骨蠟修補(bǔ)骨窗，假手術(shù)組開骨窗不作打擊，骨窗修補(bǔ)后縫合皮膚。將亞低溫組大鼠置于冰床并以0℃冰水浸浴，乙醇擦拭，測(cè)量并維持肛溫（32±0.5）℃，持續(xù)6 h。

1.2.2 大鼠改良神經(jīng)功能評(píng)分 各組隨機(jī)取6只大鼠于建模后1、3、5、7d行大鼠改良神經(jīng)功能評(píng)分（modified neurological function score，mNSS），評(píng)分項(xiàng)目：感覺試驗(yàn)（2分）、反射缺陷（4分）、運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)（6分）平衡木試驗(yàn)（6分），共18分，評(píng)分越高神經(jīng)功能越差［9-10］。

1.2.3 MRI檢測(cè)及腦組織取材 各組取剩余大鼠分別于6、12、24、48h各取6只，以3%水合氯醛麻醉后行3.0TMRI檢查，采用飛利浦Achieva3.0T磁共振成像系統(tǒng)和大鼠專用頭顱線圈，T2W：TR4.0s，TE100ms，層數(shù)9層，層厚1.5 mm，層間距0.3 mm，反轉(zhuǎn)角90°，成像時(shí)間4分8秒，原始圖像傳輸至工作站后劃出T2W高信號(hào)區(qū)為損傷灶和水腫區(qū)，軟件計(jì)算各層面相應(yīng)面積，損傷水腫區(qū)體積=各層面損傷水腫區(qū)面積和×（層厚+層間距）［11］，檢查完畢后大鼠處死后取腦組織，備用。

1.2.4 Western bolt測(cè)定CAM表達(dá) 各組各時(shí)間點(diǎn)取50 mg腦組織樣本，加入500 μL組織細(xì)胞裂解液和5 μLPMSF，置于研磨儀研磨后冰上裂解10 min，14000轉(zhuǎn)/min離心15 min后將上清液轉(zhuǎn)移到EP管，并使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度。EP管按比例加入Loading Buffer后震蕩離心并100℃煮沸10 min，置于-80℃保存。根據(jù)濃度確定上樣量后依次上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，分離膠15%，濃縮膠5%，電泳結(jié)束后將膠轉(zhuǎn)移至甲醇浸泡1 min后的PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件：恒壓100 V，40 min，膜孔徑0.2 μm，轉(zhuǎn)膜后 PBST洗5 min，脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST洗3次，每次5 min。孵育一抗：兔抗鼠Anti-Calmodulin，兔抗鼠Anti-GAPDH抗體，4℃冰箱搖床過夜，PBST洗5次，每次5 min，加入二抗山羊抗兔IgG H&L HRP，PBST洗5次，每次6 min，ECL發(fā)光液均勻覆蓋，運(yùn)用紅外激光成像系統(tǒng)顯影曝光，對(duì)目的和內(nèi)參蛋白進(jìn)行半定量分析，運(yùn)用Image J軟件測(cè)定灰度值，蛋白表達(dá)量用CAM/GAPDH表示。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠取腦后腦組織立即放入4%多聚甲醛避光固定12 h，之后蔗糖溶液常規(guī)脫水，石蠟包埋，腦組織石蠟塊行冠狀位切片，厚度4 μm，行免疫組化染色：①脫蠟，60℃烤箱烤片30 min；②水化，二甲苯I 10 min，二甲苯II 8 min，二甲苯III 8 min，95%乙醇5 min，80%乙醇3 min，70%乙醇3 min，蒸餾水洗3次，5 min/次，PBS洗3次，5 min/次；③熱抗原修復(fù)，配置檸檬酸鈉抗原修復(fù)液，高壓鍋煮沸后放入玻片，緩慢升壓維持15 min，自然冷卻，PBS洗3次，5 min/次；④滅活 ，3%H2O2，37 ℃10 min，PBS洗3次，5 min/次；⑤封閉，山羊血清室溫封閉10 min，傾去多余液體；⑥一抗兔抗鼠 Anti-Calmodulin，1∶2000，4℃過夜，PBS洗3次，5 min/次，滴加二抗山羊抗兔IgG，1∶1000，室溫30 min，PBS洗3次，5 min/次；⑦加入辣根過氧化物標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，室溫30 min，PBS洗3次，5 min/次；⑧DAB顯微鏡下顯色5～10 min，水沖洗10 min；⑨脫水、干燥、封片、鏡檢。各組各時(shí)間點(diǎn)選取5張切片，顯微鏡下每張任選10個(gè)完整不重復(fù)的400倍視野，計(jì)數(shù)有棕黃色顆粒或斑片的陽性細(xì)胞并取平均數(shù)。

1.2.6 熒光定量PCR 各組各時(shí)間點(diǎn)于冰上取約100 mg組織，于1 mL預(yù)冷的Trizol中充分研磨，勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，加入250 μL三氯甲烷，充分混勻，冰上靜置5min，溶液離心10 000×g，10 min。吸取上清液500 μL于1.5 mL EP管中，加入等體積4℃預(yù)冷的異丙醇并混勻，-20℃靜置15 min。溶液4 ℃，10 000×g，10 min離心，倒去液體，加入1 mL 4℃預(yù)冷75%乙醇并混勻，清洗RNA沉淀，4℃，10 000×g，5 min離心，倒去液體，干燥，加入10 μL RNase-Free Water，充分溶解RNA。運(yùn)用260 nm波長(zhǎng)分光光度儀測(cè)定RNA濃度。按試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Calmodulin的上游引物為5′-TTGATAAAGATGGGGACGGC-3′，下 游 引 物 為 5′-CTGATGTAGCCATTGCCATCC-3′，內(nèi)參GAPDH的上游引物為 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物為 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。取樣本 1 μL，引物工作液1 μL，2× qPCR 預(yù)混液5 μL，ddH2O 2.8 μL，Rox0.2 μL配置反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，1 min；95 ℃，15 s→58 ℃，20 s→72 ℃，45 s循環(huán)40次；熔解曲線為60℃→95℃，每20 s升溫1℃。運(yùn)用ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料使用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）描述，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)組間均值的比較使用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 改良神經(jīng)功能評(píng)分 亞低溫組、常溫組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05），大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能行為障礙。亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分較常溫組明顯減輕（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白 mRNA及蛋白的表達(dá) 常溫組、亞低溫組大鼠各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)量較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）。亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)量較常溫組明顯降低（P＜0.05）。亞低溫組大鼠6、12、24 h后鈣調(diào)蛋白mRNA較常溫組明顯降低（P＜0.05），48 h時(shí)鈣調(diào)蛋白mRNA與常溫組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1，表2。

表1 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分Table 1 Modified neurological severity scores of different groups of rats at different days(xˉ±s，score)

表1 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分Table 1 Modified neurological severity scores of different groups of rats at different days(xˉ±s，score)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與常溫組比較，#P＜0.05

組別假手術(shù)組常溫組亞低溫組n666 1 d 0 11.53±1.60*8.84±0.75*#3 d 0 9.72±1.15*7.50±0.62*#5 d 0 7.61±0.92*5.71±0.55*#7 d 0 5.38±.0.70*4.05±.0.42*#

圖1 Western bolt測(cè)定鈣調(diào)蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表2 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白mRNA相對(duì)定量結(jié)果Table 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s)

表2 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白mRNA相對(duì)定量結(jié)果Table 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與常溫組比較，#P＜0.05

組別假手術(shù)組常溫組亞低溫組n 24 24 24 mRNA表達(dá)量6 h 1.06±0.07 2.76±0.25*1.83±0.19*#12 h 1.04±0.05 2.49±0.18*1.72±0.12*#24 h 1.00±0.02 2.04±0.14*1.59±0.06*#48 h 0.95±0.04 1.65±0.09 1.60±0.07蛋白表達(dá)量6 h 0.629±0.026 1.124±0.038*0.919±0.018*#12 h 0.633±0.020 1.149±0.031*0.943±0.025*#24 h 0.626±0.020 0.932±0.029*0.707±0.021*48 h 0.632±0.023 0.876±0.020*0.731±0.016*#

2.3 各組各時(shí)間點(diǎn)腦組織免疫組化結(jié)果 假手術(shù)組鈣調(diào)蛋白表達(dá)微弱，常溫組、亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)的免疫組化鈣調(diào)蛋白表達(dá)較假手術(shù)組增加（P＜0.05），亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化鈣調(diào)蛋白表達(dá)量較常溫組下降（P＜0.05），結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果符合，見表3，圖2。

2.4 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織MRI 假手術(shù)組大鼠腦組織MRI表現(xiàn)正常，無異常信號(hào)影，腦組織結(jié)構(gòu)完好；常溫組大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦組織有明顯挫傷伴水腫形成，皮質(zhì)連續(xù)性破壞；亞低溫組大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦水腫程度和范圍較常溫組明顯降低，見表4，圖3。

表3 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化鈣調(diào)蛋白表達(dá)情況Table 3 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表3 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)免疫組化鈣調(diào)蛋白表達(dá)情況Table 3 Expression of the CAM protein in the brain tissue of different groups of rats at different hours

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與常溫組比較，#P＜0.05

組別假手術(shù)組常溫組亞低溫組n 24 24 24 6 h 28.34±3.25 86.32±5.23*66.83±4.62*#12 h 30.25±2.17 95.68±5.88*71.65±5.06*#24 h 29.29±2.78 72.51±4.92*58.81±3.98*#48 h 29.72±2.61 65.72±4.81*49.92±3.65*#

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)免疫組化結(jié)果Figure 2 Expression of CAM mRNA in the brain tissue of different groups of rats at different hours

表4 大鼠各組各時(shí)間點(diǎn)腦組織損傷水腫區(qū)體積(xˉ±s，mm3)Table 4 Volume of brain edema in the brain tissue of different groups of rats at different hours(xˉ±s，mm3)

圖3 大鼠腦組織MRI表現(xiàn)Figure 3 MRI manifestations of the brain tissue in different groups of rats at different hours

3 討 論

顱腦創(chuàng)傷后興奮性氨基酸增加和神經(jīng)細(xì)胞凋亡異常激活，抑制凋亡可能改善神經(jīng)細(xì)胞壞死和腦損傷預(yù)后［12］。而鈣調(diào)蛋白可調(diào)控興奮性氨基酸如Glu的釋放，激活細(xì)胞異常凋亡，從而造成神經(jīng)細(xì)胞壞死［13］。從而我們推測(cè)顱腦創(chuàng)傷的機(jī)制和鈣調(diào)蛋白存在密切聯(lián)系。

亞低溫能改善顱腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)，通過抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，減少組織耗氧量等機(jī)制，降低顱內(nèi)壓，保護(hù)血腦屏障，發(fā)揮腦保護(hù)作用［14-16］。顱腦創(chuàng)傷后興奮性氨基酸大量釋放造成“興奮性毒性”引起繼發(fā)性腦損傷，而亞低溫能降低顱腦創(chuàng)傷后興奮性氨基酸受體如NMDAR1表達(dá)［17］。而鈣調(diào)蛋白可通過鈣調(diào)蛋白依賴激酶II增加興奮性氨基酸受體NMDAR的活性且增加興奮性氨基酸的釋放［18］。所以我們推測(cè)亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制和鈣調(diào)蛋白存在關(guān)系并進(jìn)行本研究。

盡管鈣調(diào)蛋白在顱腦創(chuàng)傷機(jī)制中起重要作用，但關(guān)于亞低溫干預(yù)顱腦創(chuàng)傷后鈣調(diào)蛋白的表達(dá)相關(guān)研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫組較常溫組同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能行為障礙減輕、mNSS降低，說明亞低溫在顱腦創(chuàng)傷后大鼠的生物行為學(xué)表現(xiàn)上起到了積極作用。常溫組、亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白mRNA及蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組明顯上調(diào)，相關(guān)研究顯示鈣調(diào)蛋白可以通過調(diào)控自由基生成、NO的釋放、興奮性氨基酸的釋放、細(xì)胞凋亡等途徑參與神經(jīng)細(xì)胞損傷。鈣調(diào)蛋白可激活鈣調(diào)蛋白依賴激酶II（CAMKII），激活下游信號(hào)通路，包括上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)，合成NO，加重氧化應(yīng)激和自由基生成，生成的神經(jīng)毒性物質(zhì)可造成細(xì)胞功能不全和血管受損等一系列繼發(fā)損傷［19］，本研究結(jié)果說明顱腦創(chuàng)傷可能通過增加鈣調(diào)蛋白表達(dá)激活上述各種損傷途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。這也與黃博聰?shù)龋?0］研究結(jié)果基本相符。亞低溫組48 h的鈣調(diào)蛋白mRNA與常溫組48 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與預(yù)想結(jié)果存在差異，原因可能是6 h亞低溫干預(yù)較48 h不夠持續(xù)，影響了亞低溫對(duì)鈣調(diào)蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制；但在蛋白表達(dá)層面，亞低溫組48 h較常溫組48 h鈣調(diào)蛋白表達(dá)降低，推測(cè)亞低溫對(duì)鈣調(diào)蛋白的抑制可能在轉(zhuǎn)錄后的層面起更主要作用，或是抑制鈣調(diào)蛋白翻譯，或是增加降解鈣調(diào)蛋白的蛋白酶活性等。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)鈣調(diào)蛋白蛋白表達(dá)量均較同時(shí)間點(diǎn)常溫組下降，說明亞低溫在蛋白分子層面發(fā)揮了生物學(xué)功能，降低鈣調(diào)蛋白表達(dá)，可能通過抑制了上述一系列顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)性腦損傷機(jī)制［19］，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

顱腦創(chuàng)傷后腦水腫是導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)功能改變和腦組織損傷的重要原因［21］，MRI結(jié)果顯示6 h腦水腫已開始形成并加重，48 h達(dá)到水腫高峰且存在繼續(xù)加重可能，亞低溫組腦水腫程度和范圍較常溫組明顯降低，可能是亞低溫降低細(xì)胞耗氧，降低炎癥反應(yīng)，減輕酸中毒和自由基產(chǎn)生，抑制血紅蛋白外滲和水電解質(zhì)失衡，從而維護(hù)了正常腦血流量并起到保護(hù)血腦屏障的作用，減輕顱腦創(chuàng)傷后腦水腫［14］，降低顱內(nèi)壓，這也與江基堯［22］等的臨床研究結(jié)論相符。

綜上所述，本研究證實(shí)了大鼠顱腦創(chuàng)傷后鈣調(diào)蛋白mRNA上調(diào)且鈣調(diào)蛋白表達(dá)增加，亞低溫干預(yù)減輕了顱腦創(chuàng)傷后腦水腫并抑制了鈣調(diào)蛋白表達(dá)，提示了亞低溫通過抑制鈣調(diào)蛋白表達(dá)影響顱腦創(chuàng)傷的損傷機(jī)制，發(fā)揮腦保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步為亞低溫治療顱腦創(chuàng)傷的臨床療效提供理論支持。