梅光明,嚴 國,2,常家琪,2,孟春英,顧 捷

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室，浙江舟山 316021; 2.浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江舟山 316021)

砷是一種普遍存在于自然界中的類金屬元素,按化合物的存在形態(tài)分為無機砷(亞砷酸鹽(As(Ⅲ)、砷酸鹽(As(Ⅴ))和有機砷(一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜堿(AsB)、砷膽堿(AsC)、砷糖和砷脂等)兩大類。砷的生物毒性與其存在的形態(tài)種類相關,無機砷是砷化合物致畸、致癌及致突變的主要來源,而有機砷通常被認為是低毒或者無毒的[1],以半致死量LD50計,毒性依次為As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>AsB>AsC[2-4]。1980年國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)就已將砷和無機砷化合物歸為對人體有致癌性的Ⅰ類致癌物質(zhì),As(Ⅲ)能和含巰基(-SH)的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合形成穩(wěn)定的螯合物進而抑制其活性[5-6],造成機體代謝障礙[7]。自然界中的砷元素通常由地表徑流等方式進入海水中,又通過食物鏈在海產(chǎn)品富集,因此海產(chǎn)品攝入成為人體暴露砷元素的主要途徑之一[8-9]。

浙江是海洋漁業(yè)大省,2017年水產(chǎn)品總產(chǎn)量643萬噸,漁業(yè)經(jīng)濟總產(chǎn)出2071億元,在努力發(fā)展?jié)O業(yè)經(jīng)濟的同時,水產(chǎn)品質(zhì)量安全也成為社會民眾和各級政府部門共同關注的熱點問題?？茖W合理評估因攝入海產(chǎn)品帶來的無機砷健康風險,需要在掌握常見海產(chǎn)品無機砷污染狀況下結(jié)合居民膳食消費數(shù)據(jù)進行風險評估分析。食品安全風險評估是當前國際公認的制定食品安全政策法規(guī)和標準、解決國際食品貿(mào)易爭端的重要依據(jù),它結(jié)合污染物濃度、膳食水平和劑量毒理效應等方面科學合理地進行潛在的風險評價。

本研究以電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)對浙江沿海常見海產(chǎn)品中砷污染情況進行監(jiān)測分析,測定了38個品種共679個海產(chǎn)品樣本中總砷及無機砷含量,并結(jié)合浙江省沿海居民水產(chǎn)品的消費數(shù)據(jù)進行無機砷攝入風險分析,為浙江沿海人群建立合理安全的海產(chǎn)品消費習慣提供指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海產(chǎn)樣品 來源于2016～2017年間的浙江臺州、溫州、寧波和舟山等地近岸海水養(yǎng)殖以及海洋捕撈的水產(chǎn)品,覆蓋魚、蝦、蟹、貝和海藻類等,采集樣品均按照《GB/T 30891-2014 水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》處理后作為待測樣品[10]；砷甜菜堿AsB溶液標準物質(zhì)(GBW 08670)、一甲基砷 MMA溶液標準物質(zhì)(GBW 08668)、二甲基砷 DMA 溶液標準物質(zhì)(GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)溶液標準物質(zhì)(GBW 08667)、亞砷酸根 As(Ⅲ)溶液標準物質(zhì)(GBW 08666) 中國計量科學研究院;砷單元素標準溶液(1000 μg/mL,GSB04-1714-2004) 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;扇貝粉(GBW10023)生物成分分析標準物質(zhì) 地球物理地球化學勘查研究所;金槍魚組織中砷形態(tài)標準物質(zhì)(BCR-627) 歐洲標準局;碳酸銨(NH4)2CO3色譜純,德國Sigma公司;甲醇、正己烷(色譜純) 德國Merck公司;硝酸(優(yōu)級純) 美國J.T.Baker公司;過氧化氫、氨水(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;質(zhì)譜調(diào)諧液(10μg/L Ce、Co、Li、Tl、Y)、內(nèi)標液(100 μg/mL Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh) 美國Agilent公司;實驗用水 為Milli-Q制備超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

AcquityTM H-class超高效液相色譜儀 美國Waters公司;7900型ICP-MS 美國Agilent公司;Centrifuge 5810高速離心機 德國Eppendorf公司;MS2漩渦混合器 德國IK公司;AL204型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;超聲清洗機 寧波海曙科生超聲設備有限公司;pH計 德國Sartorius公司;ETHOS 1型微波消解儀 意大利Milestone公司;微控數(shù)顯電熱板及趕酸架 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;氣浴恒溫振蕩器 江蘇常州國華電器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制 砷形態(tài)物標準儲備溶液:將5種不同形態(tài)砷(AsB、MMA、DMA、As(Ⅲ)、As(Ⅴ))的標準物質(zhì)溶液取適量分別準確轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中,用超純水分別定容至5 mL,其濃度分別為14.72、9.54、22.17、28.78、6.88 μg/mL,于4℃避光保存,備用。

砷形態(tài)物混合標準使用液:分別準確移取5種不同形態(tài)砷(AsB、MMA、DMA、As(Ⅲ)、As(Ⅴ))的標準儲備溶液340、524、226、174、727 μL于5 mL容量瓶中,用超純水容至5 mL,使各組分質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷形態(tài)標準曲線系列:分別準確移取砷形態(tài)物混合標準使用溶液50、100、250、500 μL用流動相定容至5 mL,使標準曲線上的點依次為10、20、50、100 μg/L,現(xiàn)用現(xiàn)配。

砷單元素標準曲線系列溶液:將1000 μg/L 砷單元素標準溶液用1%硝酸逐級稀釋到1.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、300 μg/L,超純水定容至5 mL備用。

硝酸溶液(0.15 mol/L):準確量取10 mL硝酸,溶于水并稀釋至1000 mL。

碳酸銨溶液(50 mmol/L):稱取2.4503 g(精確至0.0001 g)碳酸銨,溶于500 mL水中,用氨水調(diào)節(jié)pH至9.5,經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾后超聲脫氣30 min后備用。

1.2.2 總砷含量測定 參照國家標準GB 5009.11-2014《食品中總砷及無機砷的測定中的方法》[11],準確稱量0.5000 g(精確至0.0001 g)在6000 r/min、15 s條件下后的待測樣品于聚四氟乙烯消解罐中,依次加入6.0 mL硝酸、2.0 mL過氧化氫溶液,搖勻后加蓋室溫下放置4 h以上,使樣品進行預消解。次日將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中,設置適宜的微波消解程序(見表1),按照相關消解步驟進行消解。消解完畢后,170～180 ℃下于趕酸架上加熱趕酸至1～2 mL,冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL,采用ICP-MS上機測定。同時做試劑空白實驗,采用扇貝粉作為質(zhì)控樣進行結(jié)果質(zhì)量控制。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.2.3 砷形態(tài)測定 前處理條件:準確稱量均質(zhì)后的待測樣品0.5000～1.0000 g(精確至0.0001 g)于50 mL離心管中,加入20 mL 0.15 mol/L硝酸溶液,3000 r/min渦旋1 min,置于氣浴恒溫振蕩器中,在50 ℃、150 r/min振蕩提取6 h以上,提取完畢后次日取出,冷卻至室溫,3000 r/min渦旋30 s,6000 r/min室溫離心8 min。移取5 mL上清液于15 mL離心管中,加入正己烷3 mL,3000 r/min渦旋1 min后再6000 r/min離心8 min,棄去正己烷層。吸取下層清液,經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后上HPLC-ICP-MS分析。按相同操作方法做試劑空白實驗,同時檢測BCR-627金槍魚組織中砷形態(tài)標準物質(zhì)進行結(jié)果質(zhì)量控制。

分離條件:Dionex IonPacAs19陰離子交換柱(250 mm×4 mm,10 μm)及保護柱(50 mm×4 mm);進樣量50 μL;樣品室溫度10 ℃,柱溫40 ℃;流動相為50 mmol/L、pH=9.5的碳酸銨溶液;等度洗脫,流速1.0 mL/min。

1.2.4 ICP-MS工作參數(shù) 使用1.0 μg/L調(diào)諧液(含Ce、Co、Li、Tl、Y)在線優(yōu)化ICP-MS各項參數(shù),使分辨率、靈敏度、雙電荷離子產(chǎn)率和氧化物離子產(chǎn)率等各項儀器性能達到最佳?？偵楹繙y定時采用1.0 μg/mL的89Y溶液在線加入作為內(nèi)標物,用于校正儀器響應信號的變化。將標準曲線系列溶液從低濃度到高濃度依次通過蠕動泵或液相色譜進樣,于ICP-MS中測定75AS的響應強度。以標準溶液濃度為橫坐標、相應的信號值為縱坐標繪制標準曲線后對樣品進行定量。ICP-MS工作參數(shù)如表2所示。

表2 ICP-MS工作參數(shù)Table 2 Work parameters of ICP-MS

1.2.5 海產(chǎn)品攝入帶來的無機砷健康風險分析 有機砷因無毒或低毒,目前國內(nèi)外標準都僅對食品中無機砷進行限量規(guī)定。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)根據(jù)毒理學試驗結(jié)果,于1988年推薦無機砷暫定每周允許攝入量(provisional tolerable weekly intake,PTWI)為15 μg/kg·bw[12],即每日允許的最大攝入量(acceptable daily intake,ADI)為0.128 mg(人體質(zhì)量以60 kg計)。結(jié)合無機砷的PTWI、實際水產(chǎn)品中無機砷的污染水平和浙江沿海居民水產(chǎn)品的消費量,進行食用水產(chǎn)品無機砷暴露風險評估。按照以下公式計算浙江沿海居民每周由消費水產(chǎn)品而攝入無機砷的量(estimated weekly intakes,EWI)[13]。

式(1)

其中：C為水產(chǎn)品中無機砷的含量,μg/kg;m為每天攝入水產(chǎn)品的消費量,kg;BW為人體質(zhì)量,以60 kg計。當EWI/PTWI≥1時,表示無機砷暴露風險較高;EWI/PTWI<1時,表示暴露風險較低,比值越小無機砷暴露風險越小。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果質(zhì)量控制

在0～300 μg/L的砷單元素標準溶液濃度下,總砷測定的標準曲線回歸方程Y=0.0093X+3.605(r2=1.0000)。GBW10024扇貝成分分析標準物質(zhì)6次平行測定均值為3.542 mg/kg,RSD為4.21%,在參考值為3.0～4.2 mg/kg范圍內(nèi)。說明本研究采用ICP-MS測定總砷含量的方法準確度高,結(jié)果可靠。

分別配制0、10、20、50、100、300 μg/L系列砷化合物混合標準溶液進行上機分析,結(jié)果表明在0～300 μg/L范圍內(nèi),5種砷化物的響應色譜峰面積值與濃度呈良好的線性關系,相關系數(shù)均大于0.998。以實際樣品測定后計算色譜圖中各目標物的峰響應信噪比(S/N),得出各砷形態(tài)物的檢出限(S/N=3)為0.008～0.014 mg/kg,定量限(S/N=10)為0.025～0.055 mg/kg(見表3)。

表3 砷化合物測定曲線、方法檢出限與定量限Table 3 Measuring curve,detection limit andquantitative limit of As

對BCR-627金槍魚組織中砷形態(tài)物質(zhì)的6次平行測定結(jié)果中,DMA測定均值為0.1501 mg/kg,RSD為4.6%;AsB測定均值3.925 mg/kg,RSD為4.2%,均落在相應的參考值范圍內(nèi)(DMA和AsB的參考值分別為(0.15±0.0225)和(3.9±0.225) mg/kg)。結(jié)果表明采用本研究中的HPLC-ICP-MS法測定水產(chǎn)品中砷形態(tài)的結(jié)果準確度和精密度高,能夠滿足分析檢測要求。

2.2 海產(chǎn)品中砷形態(tài)分布特征

以魚、蝦、蟹、貝和藻類中的代表性海產(chǎn)品種來研究海產(chǎn)品中的砷形態(tài)分布特征。圖1為本方法中5種砷形態(tài)混合標準溶液的HPLC-ICP-MS法測定色譜圖,圖2～圖6分別為代表性海產(chǎn)品鯧魚、南美白對蝦、貽貝、梭子蟹和海帶中砷形態(tài)測定的色譜圖。測定譜圖和定量結(jié)果均表明這5類海產(chǎn)品中的總砷含量都較高,但主要以砷甜菜堿等有機砷化合物存在,少量樣品有MMA和DMA檢出,無機砷僅有微量檢出,定量分析數(shù)據(jù)表明有機砷含量占總砷含量的90%以上。圖6中的海帶樣品測定結(jié)果與標準品圖譜比對,從保留時間上將主要砷形態(tài)物定性為AsB。但根據(jù)目前文獻資料表明,該形態(tài)物可能為另一種有機砷化合物—砷糖。李衛(wèi)華等[14]研究也發(fā)現(xiàn)海藻中砷糖OH和砷甜菜堿AsB在陰離子交換色譜中因出峰時間一致無法分離,進一步運用陽離子交換色譜實現(xiàn)了二者分離,并證明海藻中沒有表明AsB。Van等[15]也運用陰離子交換色譜和陽離子交換色譜與ICP-MS聯(lián)用,同時結(jié)合HPLC-ES-MS確認了3種中國常見海藻(海帶、皺紫菜、麒麟菜)中以砷糖為主,其中海帶還有部分DMA檢出。Taylor等[16]調(diào)查發(fā)現(xiàn)新英格蘭地區(qū)的10種海藻中的總砷含量在4～106 mg/kg,大部分也都是以砷糖形式存在。郭瑩瑩[17]在對海藻中砷化合物研究時發(fā)現(xiàn),不同種類海藻樣品中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA這四種形態(tài)僅占總砷含量的3.31%～3.56%,其他形態(tài)(AsB、TMAO、砷糖和砷脂等)占總砷百分比為95%以上;劉永濤[18]建立了海帶和紫菜中砷糖的高分辨率質(zhì)譜研究,結(jié)果表明海帶中的砷主要以砷糖-OH、砷糖-PO4和砷糖-SO3三種砷糖形式存在,紫菜中的砷主要以砷糖-OH和砷糖-PO4存在。因此本實驗中海帶的砷化合物也很可能就是砷糖類。

圖1 5種砷形態(tài)混合標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution of five arsenic species

圖2 鯧魚的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS測定色譜圖Fig.2 Chromatogramof arsenic speciation in Pomfret determined by HPLC-ICP-MS

圖3 南美白對蝦的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS測定色譜圖Fig.3 Chromatogramof arsenic speciation in penaeus vannamei determined by HPLC-ICP-MS

圖4 貽貝的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS測定色譜圖Fig.4 Chromatogramof arsenic speciation inmussels determined by HPLC-ICP-MS

圖5 梭子蟹的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS測定色譜圖Fig.5 Chromatogramof arsenic speciation in crab determined by HPLC-ICP-MS

圖6 海帶的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS測定色譜圖Fig.6 Chromatogramof arsenic speciation in kelp determined by HPLC-ICP-MS

2.3 浙江沿海海產(chǎn)品中砷污染情況調(diào)查

為了全面掌握浙江沿海地區(qū)常見海產(chǎn)品中總砷及無機砷污染狀況,對38個品種共計679個海產(chǎn)品樣品(覆蓋魚、蝦、貝、頭足類、蟹類和海藻類)中的總砷及無機砷含量進行了抽樣檢測分析,結(jié)果見表3所示?？偵楹烤捣秶?.36～35.91 mg/kg,全部樣品中451個樣品有無機砷檢出(方法檢出限值以上),檢出率為66.4%,檢出值范圍為0.012～0.38 mg/kg,檢出平均值為0.046 mg/kg,全部樣品無機砷測定值均低于GB 2762-2017中的限量值要求。不同種類的水產(chǎn)品中無機砷含量有一定差異性,從平均值進行比較,海藻類(0.166 mg/kg)>海蟹類(0.10 mg/kg)>貝類(0.052 mg/kg)>頭足類、魚類(0.011 mg/kg)>蝦類(0.0080 mg/kg)。

2.4 居民海產(chǎn)品無機砷攝入的暴露風險分析

浙江省疾控中心發(fā)布的2010-2012年浙江省居民營養(yǎng)與健康狀況監(jiān)測結(jié)果如圖7顯示,我省居民魚蝦類人均消費量為55.4 g/d(其中大城市、中小城市和農(nóng)村分別為94.3、39.7和30.5 g/d)。根據(jù)表3的679個常見海產(chǎn)品中無機砷監(jiān)測結(jié)果,以全部樣品中無機砷含量的中位數(shù)值(0.024 mg/kg)和第95百分位數(shù)的含量值(0.14 mg/kg)、人群平均體重按60 kg計,采用公式(1)計算因食用海產(chǎn)品帶來的無機砷一般攝入水平(EWI50)和高攝入水平(EWI95),結(jié)果見圖7所示。浙江省大城市、中小城市和農(nóng)村居民因食用水產(chǎn)品引起無機砷攝入在一般水平下的EWI50值分別為0.26、0.11和0.085 μg/kg·bw,高攝入水平下的EWI95值分別為1.54、0.65和0.50 μg/kg·bw,均遠小于JECFA推薦的人體每周可攝入無機砷的PTWI值15 μg/kg·bw。但同時綜合考慮人體攝入無機砷的飲食途徑較多,海產(chǎn)品只是眾多飲食消費中的一部分。根據(jù)吳永寧等[19]在2009-2013年進行的第五次中國膳總膳食研究數(shù)據(jù),浙江省居民膳食無機砷的攝入量中水產(chǎn)類的貢獻為3.2%,評估得出:浙江省大城市、中小城市和農(nóng)村居民在長期攝入一般無機砷含量水平污染的水產(chǎn)品時,因食物總膳食引起的每周無機砷攝入量分別為8.12、3.44和2.66 μg/kg·bw;而在長期攝入高無機砷含量水平污染的水產(chǎn)品時,因食物總膳食引起的每周無機砷攝入量別為48.1、20.3和15.6 μg/kg·bw,均超過JECFA組織推薦的PTWI值15 μg/kg·bw。風險分析結(jié)果表明浙江沿海居民食用一般海產(chǎn)品引起的無機砷安全風險較低,但長期食用無機砷相對含量較高的海產(chǎn)品(如海藻、貝類)時,存在一定的健康風險。特別是幼童、孕婦或計劃懷孕的婦女等汞敏感人群要避免一次性大量或長期食用無機砷含量較高的海產(chǎn)品。

表3 浙江沿海水產(chǎn)品砷元素含量分布特征Table 3 Distribution characteristics of arsenic content in seafoods from Zhejiang coast

續(xù)表

圖7 浙江省人群因膳食引起的無機砷攝入量評估Fig.7 Evaluation of inorganic arsenic intake caused by diet in Zhejiang province

3 結(jié)論

對浙江沿海38個品種共計679個海產(chǎn)品樣本中的總砷及砷形態(tài)物進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)總砷含量均值范圍為0.36～35.91 mg/kg,66.4%的樣品有無機砷檢出,無機砷含量0.012～0.38 mg/kg,中位值為0.024 mg/kg,第95百分位數(shù)值為0.14 mg/kg,無機砷含量均低于GB 2762-2017中的限量值要求。海產(chǎn)品中砷化合物主要以砷甜菜堿或砷糖等有機砷形態(tài)存在,占總砷含量的90%以上。結(jié)合浙江省居民水產(chǎn)品消費情況對食用海水產(chǎn)品的無機砷攝入風險分析顯示:浙江沿海居民食用一般海產(chǎn)品引起的無機砷安全風險較低,每周因水產(chǎn)品或總膳食消費引起的無機砷攝入值均低于JECFA推薦的人體無機砷每周可攝入值;但長期食用無機砷相對含量較高的海產(chǎn)品(如海藻、貝類)時,因食物總膳食引起的每周無機砷攝入量可能會超出人體每周可攝入值,存在一定的健康風險。