張杏亞,李 姣,李亞蕾

(寧夏大學農(nóng)學院,寧夏銀川 750021)

我國牛肉產(chǎn)量僅次于美國和巴西,居世界第三位,牛肉人均消費量約5kg,僅為世界均值的1/2,亞洲均值的40%,我國牛肉有較大的發(fā)展空間。牛肉具有高蛋白、低脂肪、味道鮮美的特點,深受人們的喜愛。目前,在我國約80%以上的牛肉消費形式都是冷鮮牛肉,由于冷鏈的不完善,在貯藏、運輸和銷售過程中易受到外界微生物污染而腐敗變質(zhì),食用價值降低[1],貨架期短,這嚴重影響了我國牛肉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。使用保鮮劑是延長冷鮮牛肉貨架期的常用方法之一,化學保鮮劑使用早,但存在安全隱患,天然保鮮劑方便安全、保鮮效果好,更利于消費者接受,成為現(xiàn)代保鮮技術(shù)研究的熱點。

近年來,不少學者以乳酸鈉[2]、雙乙酸鈉、山梨酸鈉、抗壞血酸、殼聚糖[3]、乳酸鏈球菌素[4]、茶多酚[5]、聚賴氨酸及納他霉素[6]為保鮮劑用于冷鮮肉的保藏,取得了一定的效果。然而,研究者并沒有考慮復配保鮮劑之間的協(xié)同及拮抗性。本文選用茶多酚、乳酸鏈球菌素、殼聚糖、聚賴氨酸、納他霉素及山梨酸鉀為保鮮劑,以冷鮮牛肉貯藏中產(chǎn)生的混合菌為研究對象,考察不同保鮮劑對冷鮮牛肉的抑菌效果,在考慮協(xié)同及拮抗性的基礎上,篩選出適宜的保鮮劑,并用響應面法進行優(yōu)化復合保鮮劑配方,為冷鮮牛肉保鮮劑的合理使用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秦川牛背最長肌 當天屠宰,購自寧夏懷遠路口新百超市;茶多酚、殼聚糖、聚賴氨酸、納他霉素、乳酸鏈球菌素(食品級) 河南東東化工產(chǎn)品有限公司;山梨酸鉀(食品級) 南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司;氧化鎂(分析純) 煙臺市雙雙化工有限公司;硼酸(分析純) 西隴化工股份有限公司;次甲基藍(生物染色劑) 上海中秦化學試劑有限公司;甲基紅(指示劑) 西隴化工股份有限公司;醋酸(分析純)、平板計數(shù)瓊脂(生化試劑) 銀川泰豐生物科技有限公司;營養(yǎng)肉湯(生化試劑) 杭州百思生物技術(shù)有限公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BCD-521WDPW冰箱 重慶海爾制冷電器有限公司;DSX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BSC-150恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;YE4A295759移液槍 大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;96孔酶標板 江蘇省海門市博陽實驗器材廠;1765半微量定氮蒸餾裝置 天長市金橋分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將牛肉密封4 ℃冷藏15 d后,表面已長大量菌斑,發(fā)粘、有氣泡、惡臭,取5 g腐敗肉放入無菌袋中,加入45 mL生理鹽水,對肉進行充分全面的清洗揉搓,洗出液則為菌懸液,置于無菌離心管內(nèi)備用[7-8]。

1.2.2 保鮮劑溶液配制 根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[9]中食品添加劑的最大使用量不同,用無菌蒸餾水溶解聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、納他霉素、茶多酚,均配制成0.03%的溶液,殼聚糖溶于2%醋酸配成0.1%的溶液。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用二倍稀釋法測定MIC:取無菌96孔平底板,從第1～12列依次加入100 μL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB),第1列再加入100 μL蒸餾水作為陰性對照,第12列再加100 μL菌懸液作陽性對照,第2列加入相應濃度的保鮮劑100 μL,混勻后吸取100 μL至第3列中,依此類推進行二倍比稀釋至第11列,混勻后棄掉100 μL,使稀釋后各孔中的受試藥物濃度倍比減少,最后于2～11號孔中各加入菌懸液100 μL,4 ℃培養(yǎng)24 h[10]。

評判標準為:有抑菌作用-菌液清澈透明;無抑菌作用-菌液混濁、有沉淀或絮狀懸浮物或在液面下或孔壁上形成菌膜[11],將有抑菌作用最低濃度記為MIC。試驗設置兩個平行,每次試驗進行兩次驗證。

1.2.4 協(xié)同拮抗效應指數(shù)(FICI)的測定 根據(jù)單一保鮮劑MIC測定結(jié)果,按棋盤稀釋法[12]略作修改進行測定。采取6×6棋盤,根據(jù)所測得的每種保鮮劑的MIC值,將每種保鮮劑的最高濃度設定為2×MIC,然后用無菌蒸餾水進行一系列雙倍稀釋。以納他霉素和乳酸鏈球菌素聯(lián)合使用為例,納他霉素以橫行方式,乳酸鏈球菌素以縱列方式,將10 μL各自不同濃度的樣液加入96孔板中,每孔再加菌懸液90 μL,使96孔板的每1橫行孔中乳酸鏈球菌素濃度不變,納他霉素濃度則依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16×MIC;96孔板的每1縱列孔中納他霉素濃度不變,乳酸鏈球菌素濃度則依次為2、1、1/2、1/4、1/8、1/16×MIC。將培養(yǎng)板震蕩均勻后于4 ℃下靜置培養(yǎng)18～24 h,觀察結(jié)果。計算FICI判定保鮮劑兩兩復配效果[13]:

FICI=[MIC(A)/MICA]+[MIC(B)/MICB]

其中,MICA和MICB分別代表A保鮮劑和B保鮮劑單獨使用時的MIC值,MIC(A)和MIC(B)分別代表A保鮮劑和B保鮮劑聯(lián)合使用時各自的MIC值。FICI≤0. 5,協(xié)同作用;0.52.0,拮抗作用,各組試驗進行兩次驗證。

1.2.5 響應面優(yōu)化復合天然保鮮劑配方 由最小抑菌濃度(MIC)的測定和棋盤稀釋法確定的保鮮劑為單因素,設計四因素三水平響應面優(yōu)化試驗,各因素水平見表1。將保鮮劑涂抹于新鮮牛肉上,0～4 ℃冷藏,進行感官評定、TVB-N值、細菌總數(shù)的測定,根據(jù)預實驗結(jié)果,冷藏7 d后腐敗開始加劇,以冷藏7 d后牛肉TVB-N值為指標進行分析,篩選出保鮮劑最佳配方。

表1 因素水平設計表Table 1 Factors and levels design table

1.2.6 最佳配方保鮮劑對冷鮮牛肉保存期的影響 分別取5 mL所篩選出來的最佳配方的保鮮劑和無菌蒸餾水涂抹于新鮮牛肉,作為最佳組和對照組,從冷藏第3 h開始,保藏時間記為第0 d,每3 d對其進行感官評定、TVB-N值、細菌總數(shù)的測定,探究最佳配方的保鮮效果。

1.2.7 最佳組合對牛肉冷藏期間感官品質(zhì)的影響 參考GB/T 17238-2008《鮮凍分割牛肉》對牛肉的感官品質(zhì)要求,按表2打分標準對檢測結(jié)果進行評分,算總分取平均值為最后綜合評分。評分標準為:按 Williams 9 級評分法進行評分:9-極好、8-很好、7-好、6-次好、5-一般、4-一般以下、3-差、2-很差、1-極差,5-可接受。

表2 感官品質(zhì)評分表Table 2 Sensory quality score table

1.2.8 最佳組合對牛肉冷藏期間揮發(fā)性鹽基氮值的影響 將試樣除去脂肪、骨及腱后,絞碎攪勻,稱取約10.0 g,置于錐形瓶中,加100 mL水,不時振搖,浸漬30 min后過濾,濾液置冰箱備用。根據(jù)GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法進行實驗[14]。

從保鮮劑處理之后第3 h開始,保藏時間為第0 d，每隔3 d進行一次揮發(fā)性鹽基氮含量的測定,試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量按公式(2)進行計算。鮮肉TVB-N含量≤15 mg/100 g,變質(zhì)肉TVB-N含量>15 mg/100 g[15]。

式(2)

式中:X-樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量,mg/100 g;V1-測定用樣液消耗鹽酸標準溶液體積,mL;V2-試劑空白消耗鹽酸標準溶液體積,mL;c-鹽酸標準溶液的實際濃度,mol/L;14-與1.00 mL鹽酸標準溶液[c(HCL)=1.000 mol/L]相當?shù)牡馁|(zhì)量,mg;m-試樣質(zhì)量,g。

1.2.9 最佳組合對牛肉冷藏期間細菌總數(shù)的影響 根據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》,變質(zhì)肉細菌總數(shù)>1.0×106cfu/g[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以TVB-N值為響應值,應用軟件Design-Expert 8.06中的Box-behnken軟件進行優(yōu)化和設計實驗,篩選最佳復合天然保鮮劑配方。并以未經(jīng)保鮮劑處理的冷藏牛肉為對照,以TVB-N值和細菌總數(shù)為檢測指標,進行了最佳配比天然保鮮劑對冷藏牛肉保鮮效果的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

參考GB 2760-2014 規(guī)定,確定聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、納他霉素、茶多酚、殼聚糖的最大使用量分別為0.25、0.5、1.0、0.3、0.3、6 g/kg。采用二倍稀釋法測定MIC,觀察各保鮮劑96孔平板菌液狀態(tài),相鄰兩個孔板菌液清澈、菌液渾濁,菌液清澈的保鮮劑濃度,即為此保鮮劑的最小抑菌濃度。實驗結(jié)果如表3所示。

表3 6種保鮮劑對菌懸液的MICTable 3 MIC of 6 kinds of preservatives on bacterial suspension

由表3可知,六種保鮮劑對牛肉低溫腐敗菌的抑菌作用為聚賴氨酸>殼聚糖>茶多酚>納他霉素>乳酸鏈球菌素>山梨酸鉀。

2.2 協(xié)同拮抗效應測定結(jié)果

通過觀察6×6棋盤MIC值,計算FICI,結(jié)果如表4所示。

表4 兩種保鮮劑單用和聯(lián)用作用效果Table 4 The effect of two kinds of preservatives alone and in combination

由表4可知，納他霉素與乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀為拮抗作用,與殼聚糖無關(guān);山梨酸鉀與聚賴氨酸為部分協(xié)同作用,與乳酸鏈球菌素、茶多酚為無關(guān)作用;納他霉素、山梨酸鉀與其他4種保鮮劑之間聯(lián)用效果不明顯,故排除。聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素、茶多酚、殼聚糖之間均為協(xié)同作用,可擴大抗菌譜,所以這四種保鮮劑可用于后續(xù)的響應面設計。

2.3 復合天然保鮮劑最佳配方的篩選

表5 響應面設計試驗結(jié)果Table 5 Response surface design experiment results

2.3.2 響應面方差分析 響應面二次回歸方程方差分析見表6。分析結(jié)果表明,回歸模型的p值<0.0001,該模型顯著性極高,失擬差F=4.01,p=0.0965>0.05,表明失擬差項不顯著,方程對實驗擬合是合適的,方程可以比較準確地預測保鮮劑作用下冷鮮羊肉的TVB-N值變化規(guī)律,同時4種保鮮劑對TVB-N值的影響均具有極顯著性(p<0.01),且存在著一定的交互作用。

表6 二次回歸方程方差分析Table 6 Quadratic regression equation analysis of variance

2.3.3 響應面分析與優(yōu)化 通過Design-Expert 8.06軟件分析,多元回歸擬合得出4個因素對冷鮮牛肉的TVB-N值的響應面分析優(yōu)化結(jié)果如圖1～圖6所示。

圖1 聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素交互作用響應面曲線Fig.1 Response surface curve of polylysine and nisin interaction

圖2 聚賴氨酸與茶多酚交互作用響應面曲線Fig.2 Response surface curve of polylysine and tea polyphenols interaction

圖3 聚賴氨酸與殼聚糖交互作用響應面曲線Fig.3 Response surface curve of polylysine and chitosan interaction

圖4 乳酸鏈球菌素與茶多酚交互作用響應面曲線Fig.4 Response surface curve of nisin and tea polyphenols interaction

圖5 乳酸鏈球菌素與殼聚糖交互作用響應面曲線Fig.5 Response surface curve of nisin and chitosan interaction

圖6 茶多酚與殼聚糖交互作用響應面曲線Fig.6 Response surface curve of tea polyphenols and chitosan interaction

各因素間的交互作用的強弱可通過響應面陡峭程度和等高線圖的形狀反映出來,當交互作用較弱時,響應面越緩,等高線呈現(xiàn)為圓形;當交互作用較強時,響應面越陡,等高線呈橢圓形。優(yōu)化結(jié)果表明AC、AB、BC響應面曲面較陡,其等高線也呈橢圓形,則表明聚賴氨酸與乳酸鏈球菌素,茶多酚之間的交互作用顯著,BD響應面曲面較緩,乳酸鏈球菌素與殼聚糖的交互作用較弱,TVB-N值隨著保鮮劑濃度的增加而發(fā)生不同程度的降低,與方差分析結(jié)果一致。使用Design-Expert 8.06軟件,通過回歸方程和響應面分析,得出了復合保鮮劑的最佳比例為聚賴氨酸109.5 mg/kg,乳酸鏈球菌素258.0 mg/kg,茶多酚152.0 mg/kg,殼聚糖130.0 mg/kg。

2.4 最佳復合保鮮劑對冷鮮牛肉保存期的影響

2.4.1 最佳復合保鮮劑對牛肉冷藏期間感官品質(zhì)的影響 按Williams 9級評分法最佳組和對照組牛肉在冷藏期間的感官變化如圖7所示。

圖7 感官評價結(jié)果Fig.7 Sensory evaluation results

由圖7可知,在肉的冷藏期間,隨著保鮮天數(shù)的增加其感官品質(zhì)呈現(xiàn)下降趨勢,對照組第6 d評分為5分(可接受),此后牛肉已不再新鮮,保鮮期為6 d;而最佳組第21 d為4.8分,低于5分牛肉已變質(zhì)，第18 d超過5分為可接受。綜上,最佳組相比對照組保質(zhì)期可達到18 d。

2.4.2 最佳組合對牛肉冷藏期間揮發(fā)性鹽基氮值的影響 利用GB 5009.228-2016[14]中半微量定氮法檢測牛肉冷藏期間的揮發(fā)性鹽基氮值， 冷鮮肉中的揮發(fā)性鹽基氮評定標準為:鮮肉TVB-N含量≤15 mg/100 g,變質(zhì)肉TVB-N含量>15 mg/100 g,最佳組和對照組的檢測結(jié)果如圖8所示。

圖8 最佳組對牛肉冷藏期間的TVB-N值的影響Fig.8 Effects of the best group on TVB-N value during beef refrigeration

從圖8可以看出,對照組第6 d TVB-N值達14.3 mg/100 g,第9 d成為變質(zhì)肉,而最佳組第6 d TVB-N值僅為4.4 mg/100 g,直到第21 d TVB-N值達到15.6 mg/100 g才成為變質(zhì)肉。與對照組相比,最佳組能明顯延長牛肉的保鮮期,使保鮮期達到18 d。

2.4.3 最佳組合對牛肉冷藏期間細菌總數(shù)的影響 通過平板計數(shù)得出最佳組與對照組細菌總數(shù)，結(jié)果如圖9所示。

從圖9可以看出,最佳保鮮劑組合對微生物有較大的抑制作用,未使用保鮮劑的空白對照組,第6 d微生物總數(shù)為1.06×106cfu/g,已超過國家次新鮮肉的標準。而最佳組到第21 d微生物總數(shù)才剛剛達到106cfu/g,因此按照微生物菌落總數(shù)來評價,最佳保鮮組合對冷藏牛肉的保鮮期可達18 d,優(yōu)于鞏雪等[4]利用幾種保鮮劑對冷鮮牛肉保鮮期的研究。

圖9 最佳組對牛肉冷藏期間的細菌總數(shù)的影響Fig.9 Effects of the best group on the total bacteria during beef refrigeration

3 結(jié)論

本實驗通過二倍稀釋法測定得到聚賴氨酸(poly-L-lysine,PL)、乳酸鏈球菌素(Nisin)、山梨酸鉀、納他霉素、茶多酚(Tea Polyphenols,TP)、殼聚糖對冷鮮牛肉腐敗菌的最小抑菌濃度分別為73、172、323、157、152、130 mg/kg;通過6×6棋盤稀釋法檢測,明確了聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、茶多酚、殼聚糖具有協(xié)同抑菌效應。通過響應面試驗得出最優(yōu)配方為聚賴氨109.5 mg/kg、乳酸鏈球菌素258.0 mg/kg、茶多酚152.0 mg/kg、殼聚糖130.0 mg/kg,將最優(yōu)配方應用于新鮮牛肉,在冷藏期內(nèi)與對照組相比可明顯延長保質(zhì)期,控制細菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的增長,同時保質(zhì)期由6 d延長到18 d。本研究篩選優(yōu)化出4種保鮮劑,為冷鮮牛肉保鮮劑的合理使用提供技術(shù)參考。