甘 瑾,何 釗,張 弘,馮 穎

(中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所,云南昆明 650213)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)是一種熱帶、亞熱帶落葉灌木或小喬木,屬大戟科(Euphorbiaceae)葉下球?qū)?Phyllanthus),野生果在中國分布面積大、產(chǎn)量高,資源十分豐富,是我國重要的經(jīng)濟(jì)林果?，F(xiàn)代大量研究證實(shí)余甘果具有預(yù)防腫瘤、降血脂、降血糖、提高免疫力、保肝等多種特殊生理功效[1-4]。針對余甘子顯著的營養(yǎng)保健價(jià)值,已有許多研究者及加工企業(yè)對其進(jìn)行了開發(fā)利用。但目前對余甘子的開發(fā)主要是對果實(shí)進(jìn)行榨汁,然后加工成飲料、精粉及含片等產(chǎn)品。余甘子果實(shí)榨汁后,剩余果渣占原果重的65%左右,大量果渣作為廢棄物堆放,會(huì)很快發(fā)酵和滋生各種霉菌,對環(huán)境造成較大的污染。多酚類物質(zhì)是余甘子多種特殊生理功能的基礎(chǔ)[1,5-7],我們的前期工作已對榨汁后得到的原汁中的多酚進(jìn)行了分離純化及抗氧化活性等方面的研究,發(fā)現(xiàn)余甘子果渣中殘留了大量的多酚類物質(zhì)[8]。如果對果渣中的多酚類物質(zhì)也進(jìn)行系統(tǒng)的開發(fā)研究,對于減少余甘子生產(chǎn)中對環(huán)境造成的污染、提高資源利用率、促進(jìn)余甘子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有積極的作用。

多酚提取方法主要包括溶劑萃取法、超聲和微波輔助提取法、超臨界萃取法及高壓快速提取法等。溶劑提取法因不容易破壞多酚結(jié)構(gòu)和活性、設(shè)備成本低、操作簡便及較適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)而應(yīng)用較多[9]。因此本文擬采用溶劑提取法,通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)曲面試驗(yàn)分析,優(yōu)化出最佳的余甘子果渣多酚提取工藝,并從抗氧化能力指數(shù)、離子還原能力、自由基清除能力和脂質(zhì)過氧化抑制能力等方面對提取物的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià),為余甘子果渣多酚的進(jìn)一步研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子果渣 余甘子果實(shí)經(jīng)壓榨后而剩余的殘?jiān)?自然干燥,粉碎過40目,水分含量為4.12%,-4 ℃貯藏,由云南天啟生物技術(shù)有限公司提供;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、AAPH、FL、Tolox、TPTZ、ABTS、β-胡蘿卜素、亞油酸等生化試劑 購于昆明庭匯科技有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AB204-S型電子分析天秤 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司;N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化儀器有限公司;ALPHA1-2LD plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司;HH-6型水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;Thermol Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多酚提取工藝 采用水浴加熱、溶劑提取的方法,在一定乙醇體積分?jǐn)?shù)、一定提取溫度、一定提取時(shí)間、一定料液比的條件下,對余甘子果渣中的多酚進(jìn)行提取,每個(gè)樣品提取3次,合并濾液,得到提取液,分析提取液多酚含量,計(jì)算多酚提取量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 在料液比為1∶25 g/mL,提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為2 h的條件下,考察不同乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對多酚提取量的影響;在料液比為1∶25 g/mL,乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%,提取時(shí)間為2 h的條件下,考察不同提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對多酚提取量的影響;在料液比為1∶25 g/mL,乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%,提取溫度為60 ℃的條件下,考察不同提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對多酚提取量的影響;在乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%,提取溫度為60 ℃,提取時(shí)間為2 h的條件下,考察不同料比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對多酚提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素,以多酚提取量為響應(yīng)值,采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法,對提取條件進(jìn)行優(yōu)化分析,得到二次回歸方程,并確定最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素及水平表見1。

表1 響應(yīng)曲面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 多酚含量測定 參考Gan等[10]的方法,吸取濃度為100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,分別加入FC顯色劑1 mL,10%碳酸鈉溶液3 mL,定容至10 mL,在30 ℃水浴中反應(yīng)2 h,于多酚顯色物最大吸收波長765 nm處測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=0.0076X+0.0491,線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9973。取經(jīng)過稀釋的提取溶液0.5 mL,每個(gè)提取液做3個(gè)平行,重復(fù)上述步驟,于765 nm處測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液多酚含量,多酚提取量根據(jù)公式(1)進(jìn)行計(jì)算:

式(1)

式中:C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的濃度(mg/mL);T為提取液的稀釋倍數(shù);V為提取液的總體積(mL);M為用于提取的樣品量(g)。

1.2.5 提取物體外抗氧化活性分析 余甘子果渣提取液經(jīng)35 ℃真空濃縮、冷凍干燥,得到果渣多酚提取物,貯藏于-18 ℃,用于抗氧化活性分析。

1.2.5.1 抗氧化能力指數(shù)(ORAC)分析 參考Chirions等[11]的方法,并進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整,即樣品、對照品及所用試劑均用pH7.4的75 mmol/L磷酸緩沖液稀釋到一定濃度,然后在96微孔板的空白孔加入25 μL pH7.4的75 mmol/L磷酸緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品孔加入25 μL不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)的Trolox溶液、樣品孔加入25 μL樣品溶液、陽性對照孔加入25 μL VC溶液、自由基AAPH孔加入25 μL 75 mmol/L磷酸緩沖液,并重復(fù)3次。并在上述微孔加入150 μL 8.16×10-5mmol/L的熒光素(FL)溶液,搖均,37 ℃加熱10 min,再加入25 μL 153 mmol/L的AAPH溶液(空白孔不加),搖均。然后每2 min測定1次各孔熒光強(qiáng)度,測定時(shí)間設(shè)置到熒光強(qiáng)度衰減到基線為止,共測定30次,激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為538 nm。

各微孔不同時(shí)間點(diǎn)的絕對熒光強(qiáng)度讀數(shù)與對應(yīng)時(shí)間的空白孔的熒光強(qiáng)度相比,得到不同時(shí)間點(diǎn)的相對熒光強(qiáng)度fn,用公式(2)計(jì)算各微孔中樣品熒光衰退的曲線下面積(AUC),按公式(3)計(jì)算曲線的延緩部分面積(NetAUC),以Trolox的不同濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的NetAUC為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=0.2324X+0.0487,R2為0.9799,根據(jù)樣品、陽性對照的NetAUC計(jì)算出一定量樣品相當(dāng)于μmol Trolox的值,即ORAC指數(shù),以μmol Trolox/μg表示。

曲線下面積(AUC)=2×(f0+f1……+fn-1+fn)-f0-fn

式(2)

式中：f0、f1、fn-1、fn為對應(yīng)測定點(diǎn)的相對熒光強(qiáng)度。

曲線的延緩部分面積(NetAUC)=AUC樣品、對照品、標(biāo)準(zhǔn)品-AUCAAPH

式(3)

1.2.5.2 鐵離子還原能力(FRAP)分析 參考Benzie等[12]的方法,并做適當(dāng)調(diào)整,分別吸取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mL的1 mmol/L FeSO4溶液,加蒸餾水補(bǔ)充至0.2 mL,再分別加入3.8 mL FRAP試劑,混勻后在37 ℃下反應(yīng)10 min,測定593 nm波長處吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),FeSO4濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=2.1599X+0.1753,R2為0.9925。取濃度為0.15 mg/mL的樣品溶液重復(fù)上述步驟,每個(gè)樣品做3個(gè)平行,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FeSO4的濃度,樣品的還原能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的濃度表示,以VC為陽性對照。

1.2.5.3 ABTS自由基清除能力的測定 按照參考文獻(xiàn)[13]的方法,并做適當(dāng)調(diào)整,將等體積的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合并置于暗處12～16 h,以制備ABTS+·溶液。用蒸餾水將ABTS+·溶液稀釋至其在734 nm波長處吸光度為0.07±0.02。在比色管中加入0.3 mL樣品稀釋液和3 mL ABTS+·稀釋溶液,6 min后測定其在734 nm 波長處的吸光度,按公式(4)計(jì)算清除率。

式(4)

式中:Ai為樣品與ABTS+·自由基反應(yīng)后體系的吸光度;Aj為樣品本身吸光度(以蒸餾水替代ABTS+·溶液);A0為未加樣品空白值(以蒸餾水替代樣品)的吸光度。

分別測定不同濃度樣品的清除率,以清除率為縱坐標(biāo),樣品濃度為橫坐標(biāo),繪制曲線,回歸方程為Y=4.1002X+20.299,R2為0.9934,以此為依據(jù)計(jì)算半抑制濃度IC50,采用VC、Trolox為陽性對照。

1.2.5.4 脂質(zhì)過氧化抑制能力的測定 采用β-胡蘿卜素漂白試驗(yàn)[14]進(jìn)行,并做適當(dāng)調(diào)整,取0.8 mgβ-胡蘿卜素溶解于10 mL氯仿中,向其中加入80 mg亞油酸以及800 mg吐溫80,40 ℃下真空濃縮去除氯仿,加入200 mL蒸餾水制成乳濁液。取5 mL上述制備好的乳濁液,加入1 mL不同濃度樣品溶液,以1.0 mL去離子水代替樣品作為對照組,混合均勻后,在470 nm波長處測定吸光度作為零時(shí)刻的吸光度。然后將反應(yīng)液置于50 ℃下水浴保溫2 h。再次測定470 nm 波長處吸光度。脂質(zhì)氧化抑制率根據(jù)公式(5)進(jìn)行計(jì)算。

式(5)

分別測定樣品不同濃度的抑制率,以抑制率為縱坐標(biāo),樣品濃度為橫坐標(biāo),繪制曲線,回歸方程為Y=2.9023X-1.0039,R2為0.9248,以此為依據(jù)計(jì)算半抑制濃度IC50,采用BHT和Trolox為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,差異分析采用SPSS軟件13.0版的One-Way ANOVA分析方法,多重比較采用Bonferroni及Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對余甘子果渣多酚提取量的影響 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對余甘子果渣多酚提取量的影響同見圖1,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%范圍內(nèi),多酚提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高逐漸提高,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)多酚提取量達(dá)到最大為132.42 mg/g;乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí),多酚提取量開始顯著下降(p<0.01),乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí),多酚提取量下降到106.14 mg/g。溶劑提取方法主要是依據(jù)相似相容的原理,浸提溶劑的極性是影響天然多酚提取量的重要因素[15],60%～70%體積分?jǐn)?shù)乙醇的極性與余甘子果渣多酚極性相似,多酚提取量較高。60%乙醇體積分?jǐn)?shù)的多酚提取量最高,但與50%、70%的多酚提取量十分相近,差異不顯著(p>0.01),因此為增加因素水平間的顯著性,從而提高響應(yīng)面模型的顯著性,宜以70%為中心,選擇50%、70%、90%三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對余甘子果渣多酚提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on extaction amount of polyphenols注:圖中不同字母表示各數(shù)據(jù)差異顯著(p<0.01),圖2～圖4同。

2.1.2 提取溫度對余甘子果渣多酚提取量的影響 提取溫度對多酚提取量的影響見圖2,當(dāng)提取溫度從40 ℃升至60 ℃時(shí),多酚提取量也隨之升高,60 ℃后,隨著溫度的升高多酚提取量有所下降,溫度升高到90 ℃時(shí)多酚提取量最低。溫度升高可增加提取物的溶解度和擴(kuò)散系數(shù),降低溶劑的黏度,但也會(huì)引起酚類化合物的降解,降低多酚提取量[16]。從顯著性分析可看出,雖然不同溫度的多酚提取量有差異,但差異顯著性不大,且無明顯的轉(zhuǎn)折點(diǎn),表明其對多酚提取量的影響不顯著,后續(xù)試驗(yàn)將不再對此因素進(jìn)行優(yōu)化,60 ℃時(shí)多酚提取量相對較高,為124.31 mg/g,因此可確定60 ℃為最佳的提取溫度。

圖2 提取溫度對余甘子果渣多酚提取量的影響Fig.2 Effects of temperature on extaction amount of polyphenols

2.1.3 提取時(shí)間對余甘子果渣多酚提取量的影響 提取時(shí)間對多酚提取量的影響見圖3,提取時(shí)間為2 h的多酚提取量與提取1、4、5 h的多酚提取量存在顯著差異(p<0.01),提取時(shí)間為2 h時(shí)的多酚提取量大于1 h的提取量,提取時(shí)間大于2 h,多酚提取量隨提取時(shí)間延長而降低。提取時(shí)間為2 h時(shí),多酚提取量最高,因此選擇1、2、3 h三個(gè)水平進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 提取時(shí)間對余甘子果渣多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extaction amount of polyphenols

2.1.4 料液比對余甘子果渣多酚提取量的影響 料液比對多酚提取量的影響見圖4,隨著料液比的增加,多酚提取量出現(xiàn)不斷升高的趨勢,料液比為1∶25 g/mL時(shí)達(dá)到最大值,隨后開始下降,當(dāng)料液比達(dá)1∶35 g/mL后多酚提取量趨于平穩(wěn)。料液比為1∶25 g/mL的多酚提取量與1∶15、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL料液比的多酚提取量相比,存在顯著差異(p<0.01),當(dāng)料液比為1∶25 g/mL時(shí),多酚提取量最高達(dá)到135.91 mg/g,因此選擇1∶15、1∶25、1∶35 g/mL三個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 料液比對余甘子果渣多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ratio of material to solvent on extaction amount of polyphenols

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)曲面回歸模型的建立與分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,綜合考慮各因素對多酚提取量影響的顯著性,確定最佳提取溫度為60 ℃,選擇以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時(shí)間(X2)、料液比(X3)為自變量,多酚提取量(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn),試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

采用Design-Expert 8.0.6對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析,得到二次多元回歸方程為:

Y=3.94+0.023X1+7.74×10-3X2+0.011X3+1.14×10-3X1X2+1.38×10-5X1X3-1.27×10-3X2X3-2.19×10-4-5.96×10-3-7.84×10-5

對回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 The variance analysis of regression model

從表3可以看出,模型p<0.01,說明該模型差異極顯著,該模型的R2=0.9477表示模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度好,也說明回歸模型能解釋94.77%響應(yīng)值的變化。該模型的失擬項(xiàng)p=0.0743>0.05,沒有顯著意義,說明數(shù)據(jù)中沒有異常的點(diǎn),模型是可靠的,能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和分析。由F值和顯著性可知,余甘子果渣多酚提取量的影響因素主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間,乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比均達(dá)到極顯著的影響(p<0.01),其中乙醇體積分?jǐn)?shù)的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均為極顯著,表明其為最主要的影響因素。

2.2.2 任意兩因素交互作用的分析 任意兩因素交互作用的響應(yīng)曲面見圖5。其中A、B、C各圖是由響應(yīng)值和各試驗(yàn)因子間構(gòu)成的立體曲面圖,顯示了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比中任意一個(gè)變量取0水平時(shí),其余兩個(gè)變量對余甘子果渣多酚提取量的影響。

圖5 任意兩變量對多酚提取量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of any two variables on extaction amount of polyphenols

圖5A是料液比為1∶25 g/mL時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對多酚提取量的交互作用。由圖可見,提取時(shí)間一定時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,多酚提取量先有一點(diǎn)緩慢上升的趨勢,隨后開始明顯下降;乙醇體積分?jǐn)?shù)大約在65%～90%的范圍時(shí),多酚提取量隨提取時(shí)間的延長有所提高,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大約在50%～65%的范圍內(nèi),隨提取時(shí)間的延長,多酚提取量的變化趨于平緩,表明乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對提取時(shí)間與多酚提取量的相關(guān)性存在一定的影響,兩者存在交互作用。

圖5B是提取時(shí)間為2 h時(shí),乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對多酚提取量的交互作用。由圖可知,當(dāng)料液比一定時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,多酚提取量的先略有上升然后快速下降;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí),多酚提取量與料液比呈正相關(guān)關(guān)系,與單因素試驗(yàn)中的變化不完全一致,可見兩因素之間具有一定的交互作用。

圖5C是乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí),提取時(shí)間和料液比對多酚提取量的交互作用。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí),多酚提取量隨料液比的增加而提高;當(dāng)料液比在大約1∶15～1∶25 g/mL的范圍內(nèi),隨提取時(shí)間增加,多酚提取量也隨之提高,而當(dāng)料液在大約1∶25～1∶35 g/mL的范圍內(nèi),多酚提取量隨提取時(shí)間延長的變化逐漸趨于平緩,可見料液比的變化對提取時(shí)間與多酚提取量的關(guān)系存在一定影響,兩因素間存在交互作用。

2.2.3 優(yōu)化提取工藝及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸模型的預(yù)測,得到余甘子果渣多酚的最佳提取工藝為:提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)為58%、提取時(shí)間為1.33 h,料液比為1∶33 g/mL,多酚提取量最大為127.31 mg/g;為了便于操作,將提取條件略做調(diào)整為:提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取時(shí)間為80 min,料液比為1∶33 g/mL,在此條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果多酚提取量為126.25 mg/g(RSD=1.39%,n=3),與預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅0.59%,說明了回歸模型的可靠性,采用該模型優(yōu)化的工藝參數(shù)是可行的。

余甘子果渣提取液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥,得到余甘子果渣多酚提取物,經(jīng)分析測定,提取物多酚含量為350.19 mg/g(RSD=0.91%,n=3)。

余甘子多酚及其抗氧化活性是余甘子多種生理功能的主要活性物質(zhì)[1,5-7],一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了余甘子果實(shí)多酚提取工藝的試驗(yàn)研究[17-22],大部分研究中均采用溶劑提取法,溶劑有乙醇、甲醛、丙酮等,多酚得率可達(dá)到2.05%～5.48%(以鮮果計(jì))[20-22]、3.87%～21.8%(以干粉計(jì))[17-19],提取物的多酚含量可達(dá)到24.7%～36.3%。唐仕榮等[23]采用亞臨界水萃取工藝對余甘子的多酚進(jìn)行了研究,多酚得率為17.08%。本文的試驗(yàn)結(jié)果顯示,作為余甘子生產(chǎn)廢棄物的果渣中多酚提取量及提取物中多酚含量,與上述研究結(jié)果相比均為較高水平,表明余甘子果渣較高的利用價(jià)值,可對其進(jìn)行深入研究開發(fā)。

2.3 多酚提取物抗氧化活性評價(jià)

采用ORAC、FRAP、ABTS及β-胡蘿卜素漂白抑制等體外抗氧化試驗(yàn),對余甘子果渣多酚提取物的抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià),結(jié)果見表4。

表4 余甘子果渣多酚提取物抗氧化活性Table 4 The antioxidant activities of extractive from emblica pomace

從表4結(jié)果可見,余甘子果渣多酚提取物作為一種粗提物,其ORAC指數(shù)已達(dá)到的VC50%以上,表明其具有較高的抗氧化活性;提取物具有一定的鐵離子還原能力,而且達(dá)到了陽性對照VC還原能力的40%以上;提取物對ABTS+·自由基的半抑制濃度IC50顯著低于(p<0.01)陽性對照VC和Trolox,表明其清除ABTS+·自由基的能力顯著高于這兩個(gè)陽性對照;提取物對β-胡蘿卜素漂白抑制的IC50與陽性對照Tolox和BHT存在顯著差異(p<0.01),提取物的IC50高于常用的脂類抗氧化劑BHT,但未達(dá)到BHT的2倍,而且顯著(p<0.01)低于Tolox,表明其也具有較高的脂質(zhì)氧化抑制能力。

體外抗氧化能力評價(jià)方法按作用機(jī)制可分為:清除生物體內(nèi)活性氧自由基、基于氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)和基于電子轉(zhuǎn)移(SET)的方法。一種評價(jià)方法只是對某一方面抗氧化能力的測定,沒有一種抗氧化方法可以對一個(gè)物質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行完全合理的評價(jià),需要同時(shí)從不同方面選擇多個(gè)方法進(jìn)行分析[24]。本文根據(jù)不同反應(yīng)機(jī)理選擇的4種評價(jià)方法結(jié)果表明,從余甘子果渣中得到的多酚提取物在抗氧化能力指數(shù)、鐵離子還原能力、自由基清除能力和脂質(zhì)過氧化抑制能力等方面都表現(xiàn)出較顯著的抗氧化活性。

在余甘原汁的生產(chǎn)過程中,剩余果渣量幾乎是原汁的2倍,原汁經(jīng)冷凍干燥得到約10%的原汁干燥物,果渣干燥得率約為38%,根據(jù)我們的前期研究[8]可知,余甘原汁干燥物中多酚含量為235.6 mg/g,FRAP還原能力為9.21 mmol FeSO4/g,清除ABTS的半抑制濃度(IC50)為32.64 μg/mL,β-胡蘿卜素漂白抑制試驗(yàn)的半抑制濃度(IC50)為121.17 μg/mL,由此可以發(fā)現(xiàn),余甘子加工生產(chǎn)中,廢棄的果渣中所含多酚類物質(zhì)總量是原汁產(chǎn)品的4倍左右,并且果渣提取物的多酚含量及抗氧化活性大大高于原汁干燥物,進(jìn)一步說明了對余甘子果渣進(jìn)行研究開發(fā)的重要性。目前本項(xiàng)目組正在進(jìn)行果渣提取物的分離純化、組成成分及功能活性的試驗(yàn)研究,旨在為余甘子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開辟新的途徑。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化,得到余甘子果渣多酚提取的最佳工藝條件:提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間80 min,料液比1∶33 g/mL,在此條件下三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果多酚提取量為126.25 mg/g,與預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.55%。提取物中多酚含量為350.19 mg/g,體外抗氧化活性評價(jià)表明余甘子果渣多酚提取物在抗氧化能力指數(shù)、鐵離子還原能力、自由基清除能力和脂質(zhì)過氧化抑制能力等方面都表現(xiàn)出較顯著的抗氧化活性。