崔欣悅,張瑞雪,周 明,朱 艷,陳 亮,馬 勇,谷瑞增,魏 穎

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的一種機(jī)制復(fù)雜的疾病[1]。當(dāng)胰島素供應(yīng)不足或胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)揮正常生理作用,致使體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝發(fā)生紊亂時,繼而發(fā)生糖尿病。隨著糖尿病病程的延長,機(jī)體內(nèi)的代謝紊亂可造成眼、腎、神經(jīng)、血管和心臟組織、器官的慢性并發(fā)癥,以致最終發(fā)生失明、下肢壞疽、尿毒癥、腦中風(fēng)或心肌梗死,甚至危及生命[2-3]。糖尿病已嚴(yán)重威脅人類健康,其中II型糖尿病是最常見的糖尿病,其患病比例約占世界范圍內(nèi)占糖尿病總數(shù)的 90%以上[4]。當(dāng)胰島素與胰島素受體(InsR)在結(jié)合過程發(fā)生信號傳導(dǎo)障礙時,會影響胰島素的正常生理調(diào)節(jié)過程,發(fā)生胰島素抵抗,同時還會影響正常的細(xì)胞凋亡。胰島素抵抗對各種器官和組織產(chǎn)生不良影響[5-6],導(dǎo)致II型糖尿病的發(fā)生。

豌豆又稱寒豆、麥豆、雪豆等,是世界性第二大食用豆類。豌豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、礦物質(zhì)和多種人體必需氨基酸[7]。豌豆肽是豌豆蛋白經(jīng)過酶解技術(shù)手段獲得的產(chǎn)物,具有較好的保水性、吸油性、乳化性和凝膠成型性,還可做為腸道營養(yǎng)劑促進(jìn)腸道益生菌生長[8]。目前,關(guān)于豌豆水解蛋白的活性研究有一些相關(guān)報(bào)道,主要集中于豌豆蛋白的抗氧化活性[9],而對豌豆蛋白水解物對胰島素抵抗形成效果作用鮮見報(bào)道。本研究通過高濃度胰島素誘發(fā)HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型,觀察胰島素抵抗對葡萄糖消耗量的影響。同時,以豌豆肽為實(shí)驗(yàn)對象通過觀察胰島素受體及凋亡蛋白含量的變化,探究不同濃度豌豆肽對胰島素抵抗形成過程中的影響,旨在為豌豆肽在糖尿病疾病上的開發(fā)和利用提供有效依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆肽 中食海氏生物技術(shù)有限公司;人肝癌細(xì)胞(HepG2) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院;DMEM低糖培養(yǎng)基 ?？寺」?BCA蛋白濃度測定試劑盒、胰酶、雙抗 碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清 杭州天杭生物科技有限公司;葡萄糖測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司;PBS、胰島素溶液 北京索萊寶科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) Amresco公司;InsR單抗、FITC標(biāo)記的單抗鼠IgG 上海拜力生物技術(shù)有限公司;DEVD-FMK ATT公司;鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊 北京圣永制藥有限公司。

CKX-4倒置相差顯微鏡 日本奧里巴斯有限公司;240i二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;C6流式細(xì)胞儀 美國BD公司;AC2-6S1生物安全柜 新加坡ESCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 利用含10%小牛血清,1%青霉素、鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液,37 ℃ 5% CO2飽和濕度下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 利用DMEM低糖完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL,接種于96孔板中,并設(shè)置空白組、胰島素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組,每組6個重復(fù)。置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,待單層貼壁后加入三種不同濃度的胰島素培養(yǎng)液(1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L)對HepG2細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),時間分別控制在24、36和48 h,通過葡萄糖氫化酶過氧化氫酶法(GOP-POD)測定不同濃度胰島素誘導(dǎo)前后HepG2/IR細(xì)胞的葡萄糖含量及消耗量變化并測定蛋白濃度排除其影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mmol/mg蛋白表示,選擇最適濃度進(jìn)及誘導(dǎo)時間行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 豌豆肽對胰島素抵抗葡萄糖消耗的影響 利用DMEM低糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)正常的HepG2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,待單層貼壁后利用濃度為1×10-6mol/L的胰島素對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)24 h,隨后加入不同濃度豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設(shè)置HepG2空白組、HepG2/IR模型組及不同濃度二甲雙胍組陽性對照(10.0、0.8 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用葡萄糖氫化酶過氧化氫酶法(GOP-POD)測定不同濃度胰島素誘導(dǎo)前后HepG2/IR細(xì)胞的葡萄糖含量及消耗量變化并測定蛋白濃度排除其影響。

1.2.4 豌豆肽對發(fā)生胰島素抵抗HepG2細(xì)胞增殖的影響 待細(xì)胞貼壁后，按1.2.2確定的1×10-6mol/L胰島素溶液誘導(dǎo)HepG2/IR細(xì)胞模型方法,在96孔板誘導(dǎo)24 h后，隨加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),每個濃度5個復(fù)孔,并設(shè)定二甲雙胍對照組(10.0、0.8 mg/mL)和HepG2空白對照組。37 ℃培養(yǎng)繼續(xù)24 h后,棄上清,每孔加入5 mg/mL的MTT 100 μL,培養(yǎng)箱孵育4 h,隨后棄去上清,每孔加入100 μL DMSO震蕩,在570 nm下進(jìn)行檢測各組吸光值,計(jì)算細(xì)胞增殖率。

增殖率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組)×100

式中:OD實(shí)驗(yàn)組及OD空白組分為別實(shí)驗(yàn)組和空白對照組的吸光值。

1.2.5 FCM檢測凋亡促進(jìn)蛋白Caspase-3表達(dá) 利用DMEM低糖完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105個/mL接于24孔板中,每孔500 μL,培養(yǎng)24 h待細(xì)胞單層貼壁后,移去培養(yǎng)基,PBS清洗一遍,隨后加入1×10-6mol/L的胰島素對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)24 h,加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設(shè)定二甲雙胍陽性對照組(10.0、0.8 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化,之后用DMEM低糖完全培養(yǎng)基停止消化收集細(xì)胞,加入FITC標(biāo)記的Caspase-3特異性抑制物DEVD-FMK 2 μL,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min,隨后離心去除上清液,PBS重懸細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞中的Caspase3陽性表達(dá)率進(jìn)行測定[10]。

1.2.6 FCM檢測HepG2/IR細(xì)胞中InsR蛋白的表達(dá)水平 分別對胰島素誘導(dǎo)后的細(xì)胞加入不同濃度的豌豆肽溶液(20.0、10.0、5.0、1.0、0.8、0.5 mg/mL),并設(shè)定二甲雙胍陽性對照組(10.0、0.8 mg/mL),培養(yǎng)和收集細(xì)胞方法如上述1.2.4。隨后每孔加入InsR單抗1 μL,1000 r/min離心2 min,用PBS洗滌,隨后加入FITC標(biāo)記的IgG抗體0.5 μL,利用流式細(xì)胞儀對其中InsR蛋白的平均熒光強(qiáng)度(MFI)進(jìn)行檢測[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

如圖1所示,隨著誘導(dǎo)時間的不斷增加,葡萄糖消耗量呈不斷減少趨勢。誘導(dǎo)24 h時,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,但對于葡萄糖消耗量實(shí)驗(yàn)組與空白組相比無明顯差異(p>0.05)。36 h時各組細(xì)胞對葡萄糖的攝取量顯著降低,但胰島素誘導(dǎo)組同空白組相比不明顯(p>0.05)。在細(xì)胞誘導(dǎo)48 h時,葡萄糖攝取量減少趨勢穩(wěn)定,1×10-6mol/L攝取量最小(p<0.05),達(dá)9.8%。因此采用1×10-6mol/L胰島素溶液誘導(dǎo)48 h可建立穩(wěn)定的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。

圖1 胰島素抵抗對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 The effect of insulin resistance on glucose consumption in HepG2 cell注:*代表相同誘導(dǎo)時間下,實(shí)驗(yàn)組與HepG2空白組相比差異顯著,p<0.05,n=6。

2.2 豌豆肽對胰島素抵抗葡萄糖消耗的影響

擇最佳胰島素抵抗模型誘導(dǎo)時間48 h進(jìn)行誘導(dǎo),葡萄糖消耗量如圖2,模型組中葡萄糖消耗量極顯著降低(p<0.01),表明成功建立HepG2/IR模型。加入各濃度豌豆肽樣品后的細(xì)胞葡萄糖消耗量較模型組提高44%～48%,說明豌豆肽溶液可顯著促進(jìn)HepG2/IR細(xì)胞葡萄糖的利用,增加糖原的合成。有研究表明,當(dāng)肝臟發(fā)生胰島素抵抗后,胰島素抑制內(nèi)源性葡萄糖生成的能力減弱同時肝糖原合成減少,導(dǎo)致肝臟葡萄糖的產(chǎn)生增加[12]。

圖2 豌豆肽對胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗影響Fig.2 The effect of pea oligopeptides on glucose consumption in HepG2/IR cells注:**代表模型組與空白組相比具有極顯著差異,p<0.01; #代表實(shí)驗(yàn)組與模型組相比差異顯著,p<0.05,n=6。

2.3 豌豆肽對發(fā)生胰島素抵抗HepG2細(xì)胞增殖的影響

如圖3所示,MTT法反映了活細(xì)胞數(shù)量的變化,在1×10-6mol/L的胰島素濃度誘導(dǎo)下,模型組對正常生長的細(xì)胞有增殖促進(jìn)作用,與空白組相比作用顯著(p<0.05)。豌豆肽實(shí)驗(yàn)組除0.8 mg/mL濃度外,其余(1.0 mg/mL豌豆肽除外)與模型組相比均對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,具有極顯著性。相反,二甲雙胍組對細(xì)胞生長具有抑制效果。

圖3 豌豆肽對胰島素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖影響Fig.3 Impact of oligopeptides from pea on the proliferation of HepG2/IR cells注:*代表模型組與空白組相比具有顯著差異,p<0.05; ##代表與模型組相比差異極顯著，p<0.01,n=5。

2.4 FCM檢測凋亡促進(jìn)蛋白Caspase-3表達(dá)

胰島素誘導(dǎo)后的細(xì)胞中活化Caspase-3陽性率與空白組相比極顯著降低(p<0.01),降低程度達(dá)50.97%(圖4),說明在細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗后,凋亡促進(jìn)蛋白Caspase-3的表達(dá)和活性降低抑制了Caspase激活細(xì)胞凋亡途徑,Caspase-3位于細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的中心位置,活化后直接參與切割細(xì)胞中多種結(jié)構(gòu)與功能蛋白,李林靜[13]考察了肝癌細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗后的促凋亡蛋白Caspase-3活性,結(jié)果與本文一致。當(dāng)豌豆肽進(jìn)行干預(yù)作用后,陽性表達(dá)率的提高說明豌豆肽樣品促進(jìn)了Caspase-3的活化,但其活化程度與陽性對照二甲雙胍水平相比還存在較大差距。

圖4 豌豆肽對胰島素抵抗肝癌細(xì)胞Caspase-3活性變化Fig.4 The change of Caspase-3 activity in HepG2/IR cells with pea oligopeptides注:**代表模型組與空白組相比具有極顯著差異,p<0.01;##:與模型組相比差異極顯著，p<0.01,n=3;圖5同。

2.5 HepG2/IR細(xì)胞中InsR蛋白的表達(dá)水平

如圖5所示,發(fā)生胰島素抵抗后細(xì)胞中InsR蛋白表達(dá)量MFI值明顯降低,與未通過胰島素誘導(dǎo)的空白組細(xì)胞相比,MFI由4.36×104降至2.55×104,降低41.5%(p<0.01)。在通過豌豆肽進(jìn)行干預(yù)后MFI值明顯提高,豌豆肽干預(yù)濃度在1 mg/mL時MFI升高最明顯,達(dá)到3.45×104。實(shí)驗(yàn)提示,高胰島素誘導(dǎo)可使HepG2細(xì)胞表面胰島素?cái)?shù)目明顯減少,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞中葡萄糖消耗量的下降,最終發(fā)生胰島素抵抗[14]。

圖5 豌豆肽對胰島素抵抗肝癌細(xì)胞InsR蛋白表達(dá)量影響Fig.5 The influence of pea oligopeptides on the expression level of InsR in HepG2/IR cells

3 結(jié)論

胰島素的生理作用調(diào)節(jié)主要是通過與各組織細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合后進(jìn)行的,其過程中的信號傳導(dǎo)出現(xiàn)任何一個環(huán)節(jié)缺陷時,均可影響胰島素正常生理調(diào)節(jié)過程從而引起胰島素抵抗的發(fā)生[15]。HepG2細(xì)胞具有正常肝細(xì)胞的生理特性并具有高表達(dá)親和力的InsR[16]。當(dāng)InsR的數(shù)目與親和力降低時,胰島素生理功能無法正常發(fā)揮,導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生,并引起正常細(xì)胞的凋亡抑制。本研究通過不同濃度的胰島素和誘導(dǎo)時間作用,建立了穩(wěn)定的IR細(xì)胞模型,測定發(fā)現(xiàn)HepG2/IR細(xì)胞中的葡萄糖消耗量較正常HepG2細(xì)胞相比明顯降低,促凋亡蛋白Caspase-3的陽性表達(dá)率降低,InsR蛋白表達(dá)下降。當(dāng)在胰島素抵抗形成過程中加以不同濃度豌豆肽溶液進(jìn)行干預(yù)時,其細(xì)胞中的葡萄糖消耗量明顯上升,同時提高了InsR蛋白及Caspase-3蛋白的表達(dá),說明有效緩解了胰島素抵抗的形成。本研究對研發(fā)具有降血糖作用的功能食品提供了理論依據(jù),對豌豆肽的特殊肽段功能結(jié)構(gòu)組成和緩解胰島素抵抗作用機(jī)理尚需進(jìn)一步深入探究。