楊彬君,易 駿,龔業(yè)滔,吳巖斌,吳錦忠,吳建國,*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建福州 350122; 2.福建教育學(xué)院理科部,福建福州 350001)

牛樟芝(AntrodiacinnamomeaT. T. Chang & W. N. Chou)又名樟芝、樟菇、牛樟菇、紅樟芝、血靈芝,屬擔(dān)子菌門菌蔁綱無褶菌目多孔菌科薄孔菌屬。牛樟芝是珍貴的藥用大型真菌,野生牛樟芝僅生于臺灣特有樹種牛樟樹干腐朽心材內(nèi)壁[1]。牛樟芝在臺灣民間已有200多年的應(yīng)用歷史,主要用于解酒、解食物中毒、止腹瀉和止吐作用等。目前已從牛樟芝中分離得到的化學(xué)成分逾百種,主要有多糖、三萜、馬來酸衍生物、安卓奎諾爾等化學(xué)成分[2]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明牛樟芝多糖具有多種生物活性,包括抗腫瘤[3]、抗炎[4]、抑制血管生成[5]、抗感染[6]、改善免疫功能[7]、調(diào)節(jié)血糖血脂[8]、保肝[9]等多種功效。多糖具有復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及豐富的生物活性,由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,通常對提取得到的粗多糖水解為單糖后再進(jìn)行檢測分析[10],常用的方法主要有高效液相色譜法(HPLC),薄層色譜法(TLC),氣相色譜法(GC)、高效陰離子交換色譜安培檢查法(HPAEC-AED)等方法,其中,TLC法靈敏度低,分離效果較差;HPAEC-AED法價格昂貴,酸水解的多糖降解不徹底影響定量分析,目前,HPLC和GC法應(yīng)用較為廣泛,具分離速度快、分離效果好,重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[11]。Su等[12]采用PMP柱前衍生化法,通過HPLC檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛樟芝多糖的單糖組成為巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖。目前,尚未發(fā)現(xiàn)GC-MS法檢測牛樟芝多糖單糖組成的相關(guān)報道。

本實驗以水提醇沉法提取牛樟芝多糖,利用紫外可見分光光度法測定多糖的總糖含量;首次應(yīng)用GC-MS分析多糖的單糖組成;最后,評價多糖對DPPH、ABTS和OH自由基的清除能力,旨在為牛樟芝的開發(fā)和質(zhì)量控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛樟芝子實體 由汕頭市君研生物科技有限公司提供,經(jīng)吳錦忠教授鑒定為多孔菌科薄孔菌屬植物牛樟芝子實體;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 德國ALDRICH公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) Sigma公司;核糖醇(批號:K22F8S29663)、D(+)-巖藻糖(批號:ASIM7L15555) 上海源葉生物科技有限公司;D(-)-阿拉伯糖(批號:15011315)、L-鼠李糖(批號:14102217) 上海士鋒生物科技有限公司;D(+)-葡萄糖(批號:D0806AS)、D-甘露糖(批號:M0425AS) 大連美倫生物技術(shù)有限公司;半乳糖(批號:100226-201105) 中國食品藥品檢定研究院;維生素C(VC) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2,6-二叔丁基對甲酚(BHT) 上海華籃化學(xué)科技有限公司;三氟乙酸、鹽酸羥按、吡啶、乙酸酐、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、硫酸、苯酚、水楊酸鈉、過硫化鉀、過氧化氫、硫酸亞鐵 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

7890B/5977A 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;UV-1800紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司;RT-04小型高速粉碎機(jī) 北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司;AR2310千分之一電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;MS105DU萬分之一天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;DZF-6051真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;HH-S型水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取 牛樟芝藥材切片,干燥后粉碎,過40目篩,60 ℃干燥至恒重。取牛樟芝粉末20 g,400 mL蒸餾水回流提取3次,真空泵抽濾,濾液合并濃縮,加入無水乙醇使乙醇終濃度達(dá)80%(V/V),4 ℃靜置24 h,室溫下離心(3000 r/min,15 min),棄去上清液,以少量無水乙醇、丙酮清洗三遍,60 ℃烘干,稱重,計算牛樟芝多糖得率[13]。

多糖得率(%)=粗多糖質(zhì)量×100/牛樟芝粉末質(zhì)量

1.2.2 粗多糖的總糖含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取無水葡萄糖10.2 mg,加蒸餾水定容至100 mL,即得濃度為0.102 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5和1 mL至具塞試管中,加水補(bǔ)至1 mL,空白對照加水1 mL,加入1 mL 5%的苯酚溶液,5 mL的濃硫酸,混勻,于100 ℃水浴加熱20 min,取出,冰水浴5 min冷卻至室溫,取對照品溶液用紫外分光光法在400～600 nm進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示在488 nm處有最大吸收,因此,本實驗以488 nm作為檢測波長[14]。

1.2.2.2 總糖含量測定 精密稱取牛樟芝多糖粉末10 mg,加水定容至25 mL,即得0.4 mg/mL的供試品溶液。取適量樣品溶液,平行三份,按上述的操作方法進(jìn)行測定粗多糖的總糖含量。

1.2.2.3 方法學(xué)考察 精密度:取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液,按上述的方法進(jìn)行測定,平行六份,計算吸光度的RSD值。

重復(fù)性:稱取牛樟芝粗多糖六份,配制成0.2 mg/mL的供試品溶液,按上述的方法測定吸光度,計算多糖總糖含量的RSD值。

穩(wěn)定性:精密量取供試品,按上述的方法測定吸光度,每15 min,測定一次,在2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定,計算吸光度的RSD值。

加樣回收率:取已知含量的樣品六份,精密加入等量的無水葡萄糖制備成供試品溶液,按上述的方法測定吸光度,計算加樣回收率。

1.2.3 多糖單糖組成的GC-MS分析

1.2.3.1 多糖的水解及糖腈乙酸酯衍生化 精密稱取牛樟芝多糖10 mg于具塞試管中,加入2 mL的2 mol/L三氟乙酸,密封,于110 ℃水解2 h,水解液揮干,再反復(fù)用甲醇溶解蒸干以除去殘留三氟乙酸,真空濃縮至干,得牛樟芝多糖的水解物,置于4 ℃冰箱中備用。精密稱取鼠李糖1.27 mg、巖藻糖1.36 mg、阿拉伯糖1.24 mg、甘露糖1.30 mg、半乳糖1.6 mg、葡萄糖1.63 mg,加入20 mg鹽酸羥胺,加入1.1 mg/mL內(nèi)標(biāo)側(cè)金盞花醇的吡啶溶液1 mL,于100 ℃中水浴30 min,取出,冷卻后加入1 mL乙酸酐,100 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min,取出,揮干,得到糖腈乙酸酯衍生物,氯仿定容至5 mL,0.22 μm濾頭過濾,進(jìn)行GC-MS分析。取牛樟芝多糖水解物按上述方法進(jìn)行糖腈乙酸酯衍生化和GC-MS分析[15]。

1.2.3.2 GC-MS檢測條件 Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.250 mm,0.25 μm);載氣:高純氦;體積流量:0.8 mL/min;分流比:20∶1;進(jìn)樣口溫度220 ℃;程序升溫:起始溫度100 ℃,10 ℃/min升至150 ℃,保持1 min;5 ℃/min升至160 ℃,保持1 min;1 ℃/min升至170 ℃,保持1 min;2 ℃/min升至180 ℃,保持1 min;1 ℃/min升至185 ℃,保持1 min;10 ℃/min升至220 ℃,保持5 min;離子源溫度230 ℃,前進(jìn)樣口溫度250 ℃,掃描質(zhì)量范圍m/z 50～500 amu。

1.2.3.3 方法學(xué)考察 精密度:將標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液進(jìn)行衍生化后連續(xù)進(jìn)樣6次,計算各單糖包括鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積RSD值。

重復(fù)性:牛樟芝多糖平行六份進(jìn)行水解和衍生化后GC-MS測定,計算各單糖含量的RSD值。

穩(wěn)定性:牛樟芝多糖經(jīng)水解衍生化后于2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣,計算半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積的RSD值。

1.2.3.4 多糖的單糖組成 按下列公式計算多糖中單糖質(zhì)量,并求得相應(yīng)單糖的摩爾數(shù)。

f=mrAs/msArm0=f(A0×ms)/As

式中,m0、mr、ms分別表示待測單糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量;A0、Ar、As分別表示待測單糖、單糖標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積;f表示相對校正因子。

1.2.4 多糖體外抗氧化活性評價

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性 分別取濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL的牛樟芝粗多糖溶液1 mL,加入0.05 mg/mL的DPPH溶液1 mL,混勻,避光反應(yīng)30 min,以甲醇代替DPPH溶液作樣品對照,以甲醇代替樣品做空白組,以不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL)的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)作為陽性對照組,采用分光光度比色法在517 nm處測定吸光度,對DPPH的清除率以下列公式計算[16]:

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.2.4.2 ABTS自由基清除活性 取7 mmol的ABTS和2.45 mmol過硫化鉀等體積混合,室溫下置于暗處放置12～16 h,得到ABTS儲備液,使用前將儲備液用蒸餾水稀釋40～45倍,使該溶液在734 nm下的吸光度值在0.7±0.02。分別取不同濃度(0.5、1、2、3、4 mg/mL)的供試品溶液0.1 mL加入3.9 mL的ABTS溶液,搖勻,室溫下放置6 min后再734 nm處測定吸光度。以不同濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)的BHT作陽性對照,以蒸餾水代替樣品做空白對照。對ABTS的清除率以下列公式計算[17]:

ABTS自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.2.4.3 OH自由基清除活性 取不同濃度(0.25、0.5、1、2、4 mg/mL)的供試品溶液1 mL,依次加入1.5 mmoL/L的硫酸亞鐵1 mL,20 mmoL/L的水楊酸鈉0.3 mL,6 mmoL/L的過氧化氫0.7 mL,搖勻,37 ℃水浴30 min,于510 nm處測定吸光度,以水代替樣品作空白對照,以水代替水楊酸鈉作樣品對照,以不同濃度(0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL)的VC作陽性對照,對羥基自由基的清除率以下列公式計算[18]:

OH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式中,A0為空白吸光度值,A1為樣品吸光度值,A2為樣品對照吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗平行做三次,實驗數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并采用SPSS 21.0軟件計算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖總糖含量測定

2.1.1 線性關(guān)系考察 以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程:Y=0.06406X+0.00162,r=0.9998。結(jié)果表明,無水葡萄糖在濃度為1.46～14.57 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.1.2 方法學(xué)考察及多糖樣品測定結(jié)果 精密度實驗結(jié)果顯示葡萄糖對照品的吸光度RSD值為2.39%,說明該儀器精密度良好;重復(fù)性實驗結(jié)果顯示供試品總糖含量的RSD值為2.71%,說明該方法重復(fù)性良好;穩(wěn)定性結(jié)果顯示該方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定,RSD值為0.7%;回收率實驗結(jié)果顯示加樣回收率范圍95.51%～102.16%,RSD為2.87%。牛樟芝多糖的得率為3.02%,粗多糖中的總糖含量為55.42%±2.13%。

2.2 多糖單糖組成

2.2.1 方法學(xué)考察 精密度實驗結(jié)果顯示鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積的RSD值分別為1.38%、0.88%、1.35%、1.29%、1.41%、1.76%,表明儀器精密度良好;重復(fù)性實驗結(jié)果顯示半乳糖、葡萄糖、甘露糖含量的RSD值分別為2.2%,3.08%,2.89%,表明該方法重復(fù)性良好;穩(wěn)定性結(jié)果顯示該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定,半乳糖、葡萄糖、甘露糖峰面積RSD值分別為2.38%,1.98%,2.73%,表明各單糖衍生物穩(wěn)定性良好。

2.2.2 牛樟芝多糖的單糖組成 多糖的單糖組成分析是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供多糖基本信息的最重要環(huán)節(jié),多糖生物活性與其單糖組成及比例等密切相關(guān)。本研究首次采用GC-MS分析鑒定了牛樟芝多糖的單糖組成,采用鹽酸羥胺肟化和乙酸酐乙?；苌ㄓ行Э朔捎谔堑漠悩?gòu)化而造成的多峰現(xiàn)象,每種單糖都能獲得單一的色譜峰,有利于進(jìn)行氣相色譜的定性和定量分析;牛樟芝多糖經(jīng)三氟乙酸水解,糖腈乙酸酯衍生化后,進(jìn)行GC-MS檢測。通過比較圖2和圖3,得知牛樟芝多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖三種單糖組成。其中,葡萄糖含量最大,甘露糖和半乳糖次之,三種單糖的摩爾比為1∶7.14∶0.96。Su等[12]采用PMP衍生化HPLC法測得牛樟芝中含有六種單糖,主要單糖組成為葡萄糖、甘露糖、鼠李糖,摩爾百分比分別為84%、7.2%、2.9%,以葡萄糖含量最高。龔勁松等[19]的實驗結(jié)果表明多糖的不同提取方法也會影響到單糖的含量分布,不同種類產(chǎn)地的蟲草測得其單糖含量差異明顯[20]。由此可見,多糖的單糖組成的檢測結(jié)果可能與樣品的來源、多糖的提取分離、衍生化和檢測方法有關(guān)。

圖2 對照品單糖和內(nèi)標(biāo)物混合樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion current profile of the mixed samples of each standard monosaccharide and internal standard注:1～7分別為鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、 核糖醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

圖3 牛樟芝多糖水解物及內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖Fig.3 Total ion current profile of the hydrolysate of the polysaccharide from Antrodia cinnamomea, as well as the internal standard注:1～4分別為核糖醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖。

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對DPPH自由基的清除能力測定結(jié)果見圖4。由圖4可知,牛樟芝多糖對DPPH自由基的清除作用與濃度呈正相關(guān),隨著濃度的增加清除作用加強(qiáng),當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL,清除率達(dá)到70.62%,多糖對DPPH自由基清除的IC50值為(0.584±0.008) mg/mL,陽性對照BHT的IC50值為(0.283±0.002) mg/mL。Wang等[21]對不同培養(yǎng)方式的牛樟芝的冷水浸提物、甲醇提取物、熱水提取物進(jìn)行體外DPPH自由基清除實驗,三者均具一定清除自由基活性,呈明顯的劑量依懶性,且與牛樟芝的培養(yǎng)方式和提取方法有關(guān)。因此,不同的樣品來源和提取方式均可影響牛樟芝提取物的DPPH自由基清除活性。本研究證實牛樟芝多糖具有良好的DPPH自由基清除活性。

圖4 牛樟芝多糖及BHT對DPPH自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of DPPH free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and BHT

2.3.2 ABTS自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果見圖5。由圖5可知,隨著牛樟芝多糖增大,對ABTS自由基的清除作用加強(qiáng),在濃度為4 mg/mL時,清除率高達(dá)98.52%,多糖清除ABTS自由基的IC50為(1.182±0.058) mg/mL,陽性對照BHT的IC50為(0.098±0.001) mg/mL。體外抗氧化研究表明不同產(chǎn)地的靈芝多糖ABTS自由基清除的IC50值分別為1.50～3.50 mg/mL[22]。由此可見,牛樟芝多糖對ABTS自由基具有一定的清除作用,其活性要高于靈芝多糖。

圖5 牛樟芝多糖及BHT對ABTS自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of ABTS free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and BHT

2.3.3 OH自由基清除活性 不同濃度的牛樟芝多糖對ABTS自由基的清除能力測定結(jié)果見圖6,由圖6可知,牛樟芝多糖對OH自由基具有一定清除作用,且清除能力隨多糖濃度增加而增大,多糖對OH自由基清除的IC50為(1.384±0.133) mg/mL,陽性對照VC清除OH自由基的IC50為(0.774±0.004) mg/mL。因此,牛樟芝多糖對OH自由基也具有較好的清除活性。已有的研究表明采用水提醇沉和膜提取工藝得到的靈芝多糖對OH自由基清除的IC50分別為1.58和1.36 mg/mL[23]。由此可見,牛樟芝多糖和靈芝多糖對OH自由基清除作用相近,但均弱于陽性對照VC。

圖6 牛樟芝多糖及VC對OH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of OH free radicals by the polysaccharide from Antrodia cinnamomea and VC

3 結(jié)論

本研究使用苯酚硫酸法測得牛樟芝粗多糖中的總糖含量為55.42%±2.13%。選取核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物,采用內(nèi)標(biāo)法測定多糖的單糖組成,實驗結(jié)果表明牛樟芝多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成,摩爾比為1∶7.14∶0.96。體外抗氧化活性結(jié)果證實牛樟芝多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基三種不同自由基具有較好的清除效果,并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。本研究測定了牛樟芝多糖的含量、單糖組成以及體外抗氧化活性,為牛樟芝的質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。