劉旻昊,齊 娜,鄧 紅,2,*,孟永宏,2,穆韋曈,郭玉蓉,2

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710119; 2.國家蘋果加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西西安 710119)

紅肉蘋果(MalusniedzwetzkyanaDieck)是一種在新疆有著悠久栽培歷史的珍貴種質(zhì),其枝、葉、花、果皮及果肉均呈現(xiàn)出微紅至深紅色[1-3]。紅肉蘋果結(jié)果早,結(jié)實力強,且具有耐貧瘠、耐修剪、抗寒、抗旱等良好的抗逆性及豐富的遺傳多樣性。除此之外,紅肉蘋果中富含多酚、多糖、有機酸、礦質(zhì)元素等多種物質(zhì),其中蘋果多酚及Ca含量幾乎是普通白肉蘋果中3倍以上,具有十分廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。而植物多酚具有防齲齒、抗氧化、抗腫瘤以及預(yù)防高血壓等多種生理功效,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域[6-8]。

目前,對紅肉蘋果的活性成分研究相對較多的是花青苷,王延玲[9]對新疆紅肉蘋果“夏紅肉”的果皮和果肉中花青苷的成分進行了鑒定,同時還研究了在發(fā)育過程中花青苷含量的變化。孫曉紅等[10]以白肉蘋果“澳洲青蘋”為對照,探討了4種不同品種的紅肉蘋果果肉在不同發(fā)育時期花青苷的含量變化以及與其合成相關(guān)的基因表達量,發(fā)現(xiàn)紅肉蘋果“新疆1號”和“紅勛5號”果肉中花青苷含量較高。王燕等[11]對紅肉蘋果“紫紅1號”果肉中的花色苷進行了研究,測定其果肉中總酚含量為2523 mg·kg-1FW,花色苷含量為228.3 mg·kg-1FW,鑒定出花色苷的主要成分有9種,同時,還采用FRAP法測定了其抗氧化能力為13.39 μmol/g,幾乎是白肉蘋果抗氧化能力的7倍,由此可以得出紅肉蘋果抗氧化活性較強。Wang等[12]研究比較了4種紅肉蘋果和2種白肉蘋果,也發(fā)現(xiàn)紅肉蘋果的抗氧化能力明顯高于白肉蘋果。蘇帆等[13]采用酚酸對新疆紅肉蘋果的花色苷進行輔色,研究結(jié)果表明4種酚酸對紅肉蘋果花色苷有明顯的增色作用并且能提高其穩(wěn)定性。Schiavano等[14]研究了紅蘋果新品種-Pelingo蘋果果汁對乳腺癌細胞及體外腫瘤增殖的抑制作用,結(jié)果表明Pelingo蘋果的天然生物活性成分可顯著抑制體外腫瘤發(fā)生和人乳腺癌細胞的生長。但目前國內(nèi)外對新疆紅肉蘋果多酚的提取、純化及其抗氧化活性的研究還比較少,僅見齊娜等[15]研究了紅肉蘋果多酚提取條件的優(yōu)化。

本文在前期獲得響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取[15]新疆紅肉蘋果多酚工藝的基礎(chǔ)上,采用大孔吸附樹脂純化多酚提取物,篩選出吸附和解析性能較高的樹脂,并優(yōu)化最佳的純化條件;進而采用高效液相色譜分析純化后的新疆紅肉蘋果多酚的組成成分及含量,最后利用體外抗氧化試驗評價紅肉蘋果多酚抗氧化活性,為進一步探討新疆紅肉蘋果多酚的抗癌活性和綜合開發(fā)利用新疆紅肉蘋果資源提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆紅肉蘋果“紅勛1號” 2017年9月采自于新疆塔城;X-5N、NKA-9、AB-8、D101、KA-II 5種大孔樹脂(表1) 西安藍曉科技新材料有限公司;標準品(沒食子酸、原兒茶酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2、綠原酸、4-羥基苯甲酸、表兒茶素、咖啡酸、表兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、金絲桃苷、鞣花酸、槲皮苷、根皮苷、槲皮素) 美國Sigma公司;分析純的福林酚、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉等 西安森博化玻儀器供應(yīng)站;氯化硝基四氮唑藍(NBT)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、硫酸甲酯吩嗪(PMS)、總膽汁酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、脂質(zhì)體等 北京孚博生物科技有限公司。

表1 不同大孔樹脂的基本性能參數(shù)Table 1 Basic properities of different macroporous resins

SB25-12DTDN超聲波機 寧波新芝生物科技股份有限公司;YHLGJ-10真空冷凍干燥 鞏義市予華儀器有限責任公司機;Multiskan Go全波長酶標儀 美國熱電公司;Thermo高效液相色譜儀 美國熱電公司;THZ-C恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司;JJ-2組織搗碎勻漿機 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚的提取 將新疆紅肉蘋果清洗、切塊、去籽后打碎成勻漿,從中取出5 g并加入一定比例75%乙醇溶液,放入冷凝回流器中,按照文獻[15]確定的功率(360 W)、溫度(62 ℃)、料液比(1∶4 g/mL)、時間(20 min)下超聲輔助提取,然后用布氏漏斗將提取液進行抽濾,并測定濾液中多酚的含量。

1.2.2 多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法測定新疆紅肉蘋果中多酚的含量,參照文獻[15-16],得沒食子酸標準曲線回歸方程為y=6.861x+0.0129,R2=0.9987(x的單位mg/mL)。吸取一定濃度的樣品溶液,在760 nm處測定吸光值,以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照,根據(jù)標準曲線回歸方程確定濃度并計算出多酚的含量M。

M=N(C×V)/ m

其中,N-稀釋倍數(shù);C-多酚濃度,mg/mL;V-樣品體積,mL;m-紅肉蘋果原料的質(zhì)量,g;M-多酚的含量,mg/g。

1.2.3 新疆紅肉蘋果多酚的大孔吸附樹脂純化

1.2.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 分別稱取適量的5種不同大孔樹脂(NKA-II、NKA-9、AB-8、D101、X-5),將其分別密封浸泡在95%的乙醇溶液中,活化48 h,用蒸餾水真空抽濾淋洗至乙醇完全洗凈;然后分別用5% NaOH溶液和5% HCl溶液充分浸泡12 h,在酸、堿溶液浸泡前后都要用蒸餾水洗至中性,完全清洗干凈后瀝干水待用。

1.2.3.2 大孔樹脂的篩選 分別測定5種大孔樹脂對1.2.1中多酚提取液的吸附量與解析率,篩選出最佳樹脂。

吸附量的測定：將5種預(yù)處理好的性質(zhì)不同的大孔樹脂(表1)分別稱取4 g,放至5個100 mL的具塞錐形瓶中,每個錐形瓶中分別加入55 mL的新疆紅肉蘋果多酚提取液(濃度為0.8 mg/mL),避光密封,放在25 ℃的恒溫振蕩器中,以120 r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)振蕩24 h,然后測定上清液中剩余的多酚含量,根據(jù)公式(1)計算出各樹脂的吸附量,從而對其吸附能力進行比較。

多酚吸附量Q=(C0-C1)×V1/M1

式(1)

式中：Q-多酚吸附量,mg/g;C0-吸附前溶液中新疆紅肉蘋果多酚的濃度,mg/mL;C1-吸附后溶液中新疆紅肉蘋果多酚的濃度,mg/mL;V1-吸附溶液的體積,mL;M1-大孔樹脂的重量,g。

解析率的測定：將吸附飽和的大孔樹脂進行抽濾,并分別用165 mL的去離子水對其進行清洗,然后用濾紙將樹脂表面的水分吸干,再將其各自放入100 mL的具塞錐形瓶中,分別加入75%乙醇洗脫液55 mL,避光密封,繼續(xù)在25 ℃恒溫振蕩器中,以120 r/min轉(zhuǎn)速振蕩24 h,然后測定上清液中多酚含量。根據(jù)以下公式(2)計算出樹脂的解析率,從而其解析能力進行比較。

解析率D(%)=(C2×V2)/[(C0-C1)×V1]×100

式(2)

式中：D-解析率,%;C0-吸附前溶液中新疆紅肉蘋果多酚的濃度,mg/mL;C1-吸附后溶液中新疆紅肉蘋果多酚的濃度,mg/mL;C2-解析后溶液中新疆紅肉蘋果多酚的濃度,mg/mL;V1-吸附溶液的體積,mL;V2-解析溶液的體積,mL。

1.2.3.3 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析動力學(xué)曲線 將預(yù)處理好的NKA-II樹脂按照1.2.3.2中方法對新疆紅肉蘋果多酚進行吸附和解析試驗,分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12和24 h時測定上清液中多酚的含量,分別繪制出NKA-II樹脂的吸附和解析動力曲線。

1.2.3.4 大孔樹脂動態(tài)吸附與解析試驗 將預(yù)處理好的NKA-II樹脂裝入層析柱(1.3 cm×26 cm),在室溫以及固定上樣濃度0.8 mg/mL，上樣流速4.0 BV/h，上樣體積3.5 BV，乙醇濃度75%條件下，按照不同的上樣濃度(0.4、0.8、1.2和1.6 mg/mL)、上樣流速(2.0 、4.0、6.0 BV/h)、上樣體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 BV)以及乙醇濃度(35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%)進行吸附,每隔一段時間測定其流出液中多酚的含量,其中固定上樣濃度0.8 mg/mL、上樣流速4.0 BV/h、上樣體積3.5 BV、乙醇濃度75%。根據(jù)樹脂使用說明書,當樣品流出液的多酚濃度達到上樣濃度的10%時,則停止吸附,此時為泄漏點。根據(jù)吸附量的大小以及泄漏點出現(xiàn)的快慢,從而確定最佳的吸附參數(shù)。待樹脂吸附平衡后,用去離子水將雜質(zhì)洗脫,再分別用相同體積的上述不同濃度乙醇洗脫劑以同樣的流速進行洗脫,將所有的洗脫液收集,測定其中多酚的含量,并計算出解析率。根據(jù)解析率的大小,從而確定最佳的操作參數(shù)。

1.2.4 純化后新疆紅肉蘋果多酚的組成分析 采用高效液相色譜(HPLC)[17-18]對純化后的新疆紅肉蘋果多酚的物質(zhì)成分進行分析。液相色譜條件：色譜柱Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm),柱溫為35 ℃,檢測波長為280 nm,流速為1.0 mL/min,進樣量為20 μL,流動相A為50%甲醇和50%乙腈的混合液,流動相B為0.2%三氟乙酸水溶液,經(jīng)過多次預(yù)實驗確定的洗脫程序見表2。

表2 高效液相色譜的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

1.2.5 新疆紅肉蘋果多酚的體外抗氧化活性

1.2.5.1 新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用 參照文獻[12,16],分別吸取0.2 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆紅肉蘋果多酚至1.5 mL的離心管中,向其中加入0.6 mL的1 mmol/L DPPH乙醇溶液,將其混勻后,在室溫下避光放30 min,然后測定在517 nm處的吸光值。分別以VC和蒸餾水代替多酚溶液作為陽性和陰性對照,以95%乙醇溶液代替DPPH溶液作為本底對照,再根據(jù)以下式(3)進行計算(A-新疆紅肉蘋果多酚溶液的吸光值;Ac-陰性對照組的吸光值;A0-本底的吸n光值)。

DPPH自由基清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(3)

1.2.5.2 新疆紅肉蘋果多酚對清除羥自由基的清除作用 參照文獻[12,16],分別吸取0.2 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆紅肉蘋果多酚溶液至1.5 mL的離心管中,向其中依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和6 mmol/L過氧化氫溶液各1 mL,均勻混合后,放置37 ℃的水浴中避光靜置1 h,然后測定在510 nm處的吸光值。分別以VC和蒸餾水代替多酚溶液作為陽性和陰性對照,同時再以蒸餾水代替過氧化氫溶液作為本底對照,再根據(jù)以下式(4)進行計算(A-新疆紅肉蘋果多酚溶液的吸光值;Ac-陰性對照組的吸光值;A0-本底的吸光值)。

羥基自由基清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(4)

1.2.5.3 新疆紅肉蘋果多酚對超氧陰離子的清除作用 參照文獻[12,16],分別吸取NBT溶液和NADH溶液各0.25 mL至10 mL離心管中,再向其中加入0.25 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆紅肉蘋果多酚溶液,最后加入0.1 mLPMS溶液,混合均勻后,測定在560 nm處的吸光值。分別以VC和蒸餾水代替多酚溶液作為陽性和陰性對照,同時再以蒸餾水代替PMS溶液作為本底對照,再根據(jù)以下式(5)進行計算(A-新疆紅肉蘋果多酚溶液的吸光值;Ac-陰性對照組的吸光值;A0-本底的吸光值)。

超氧陰離子清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(5)

1.2.5.4 新疆紅肉蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用 參照文獻[12,16],將20 mg卵磷脂溶于5 mL的磷酸緩沖液中(0.05 mol/L,pH=7.4),配制脂質(zhì)體。分別取0.1 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆紅肉蘋果多酚溶液和0.04 mL的脂質(zhì)體加入1 mL離心管中,混勻,再向其加入0.01 mL FeSO4溶液(50 mmol/L),最后用磷酸緩沖液補足至總體積為0.6 mL。然后將其放入37 ℃水浴中,靜置40 min,然后分別加入TBA(0.8%)和TCA(10%)各0.2 mL,放置100 ℃水浴中加熱15 min,待其冷卻后以5000 r/min離心10 min。測定上清液在532 nm處的吸光值。分別以VC和磷酸緩沖液代替多酚溶液作為陽性和陰性對照,同時再以磷酸緩沖液代替FeSO4溶液作為本底對照,再根據(jù)以下式(6)進行計算(A-新疆紅肉蘋果多酚溶液的吸光值;Ac-陰性對照組的吸光值;A0-本底的吸光值)。

脂質(zhì)過氧化抑制率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理,同時利用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆紅肉蘋果多酚的樹脂純化

2.1.1 不同樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的吸附與解析能力的比較 由于不同種類的大孔樹脂物理結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)的不同,對于多酚的吸附與解析性能也不相同。試驗所用5種不同類型大孔樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的吸附能力比較結(jié)果見圖1a;不同大孔樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的解析效果見圖1b。如圖1a所示,5種不同的大孔樹脂均可以吸附新疆紅肉蘋果多酚,但是NKA-II樹脂吸附性能最好,吸附量達到(16.47±0.1150) mg/g,其次是AB-8樹脂,吸附量為(15.66±0.0832) mg/g,吸附量最低的為D101樹脂,吸附量僅為(14.43±0.1212) mg/g,各組之間差異極顯著(p<0.01)。圖1b結(jié)果顯示了不同大孔樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的不同解析效果,可以看出NKA-II樹脂的解析率最高,達到94.29%±2.14%,顯著高于其他幾種樹脂。因此,根據(jù)大孔樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的吸附量和解析率的結(jié)果綜合考慮,本試驗選取吸附和解析能力最好的NKA-II樹脂進行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗。

圖1 不同類型大孔樹脂對新疆紅肉蘋果多酚的吸附與解析能力比較Fig.1 Comparison of adsorption and desorption capacity of different macroporous resins to the polyphenol from red-flesh apple of Xinjiang注：圖1a:吸附能力，圖1b：解析能力；不同大寫字母表示各組之間差異極顯著(p<0.01)。

2.1.2 NKA-II樹脂的靜態(tài)吸附與解析動力學(xué)曲線 NKA-II樹脂的靜態(tài)吸附與解析動力學(xué)曲線如圖2a、2b所示。從圖2a中可以看出,在0～6 h時,新疆紅肉蘋果多酚的吸附量快速上升,達到6 h時,然后趨于平緩。從圖2b中可以看出,多酚解析率隨著時間的增長明顯上升,當?shù)竭_10 h后,解析率變化不再明顯,基本保持穩(wěn)定。由此,可以得出,NKA-II樹脂分別在6 h和10 h時對新疆紅肉蘋果多酚的吸附和解析達到平衡。

圖2 NKA-II樹脂靜態(tài)吸附與解析新疆紅肉蘋果多酚的動力學(xué)曲線Fig.2 Static adsorption and desorption kinetics curve of NKA-II macroporous resin to the polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a為吸附動力學(xué)曲線，b為解析動力學(xué)曲線。

2.1.3 NKA-II樹脂的動態(tài)吸附與解析試驗

2.1.3.1 上樣濃度的確定 從圖3a中可以看出,當上樣濃度分別為0.4、0.8、1.2和1.6 mg/mL時,它們的泄漏點分別出現(xiàn)在5、3.5、3和1.5 BV附近。當上樣濃度為0.4 mg/mL時,泄漏點出現(xiàn)的時間過晚,不太適用于實際操作,而且上樣時間過長,難免會造成多酚的氧化損失。但是當上樣濃度為1.6 mg/mL時,泄漏點出現(xiàn)的過早,多酚的上樣量會比較少,除此之外,多酚濃度過高,溶液的黏度會比較大,容易堵塞樹脂,使其吸附性能降低。當上樣濃度為0.8和1.2 mg/mL時,泄漏點出現(xiàn)時間適當,但是根據(jù)流出液多酚濃度和收集體積計算出前者的吸附量(96.30 mg)明顯高于后者的吸附量(75.28 mg)。因此,綜合泄漏點出現(xiàn)的時間以及吸附效果考慮,將新疆紅肉蘋果多酚的上樣濃度確定為0.8 mg/mL。

圖3 NKA-II樹脂新疆紅肉蘋果多酚的動態(tài)吸附與解析試驗結(jié)果Fig.3 Experimental results of dynamic adsorption and desorption of NKA-II macroporous resin to the polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a:上樣濃度對NKA-II樹脂吸附性能的影響;b:上樣流速對NKA-II樹脂吸附性能的影響;c:上樣體積對NKA-II樹脂吸附性能的影響;d:不同乙醇洗脫液濃度對NKA-II 樹脂吸附的新疆紅肉蘋果多酚解析率的影響。

2.1.3.2 上樣流速的確定 從圖3b可看出當上樣的流速為2.0 BV/h時,泄漏點在上樣體積為7.0 BV左右出現(xiàn),雖然計算出吸附量高達190.38 mg,但是泄漏點出現(xiàn)的過晚,上樣的時間過長,效率太低。當上樣的流速為6.0 BV/h時,泄漏點出現(xiàn)過早,在1.0 BV附近,計算出吸附量僅為27.50 mg,而且流速過快,也會導(dǎo)致多酚溶液沒有時間與樹脂接觸,還沒有完全吸附,便已經(jīng)流出,從而使吸附率降低。當上樣的流速為4.0 BV/h時,泄漏點出現(xiàn)時間合適,在3.5 BV左右,吸附量也較高,達到97.70 mg。因此,根據(jù)純化效率和成本綜合考慮,上樣流速選擇4.0 BV/h最佳。

2.1.3.3 上樣體積的確定 從圖3c中可以看出,從0 BV開始,上樣體積增大,流出液中多酚的濃度逐漸呈現(xiàn)的是逐漸上升的趨勢,當上樣體積為3.5 BV時,達到泄漏點,流出液中多酚的濃度為0.08 mg/mL,但是繼續(xù)增大上樣體積,流出液中多酚濃度也會繼續(xù)增大,吸附量會隨之降低。因此,上樣體積選擇3.5 BV最佳。

2.1.3.4 洗脫液濃度的確定 一般情況下,多酚類物質(zhì)在乙醇、甲醇、丙酮等極性溶劑中解析率均很高,具有較好的洗脫效果,其中乙醇作為解析劑,價廉易得、安全無毒性。因此,選用乙醇溶液作為洗脫劑,從圖3d可以看出,從乙醇洗脫液濃度為35%開始,多酚解析率逐漸增大,當濃度達到75%時,達到最大解吸率,為96.56%,但隨后解析率隨乙醇濃度的增大而降低。因此,綜合考慮,乙醇洗脫液濃度選擇75%最佳。

2.2 純化后新疆紅肉蘋果多酚的組成成分分析

純化后新疆紅肉蘋果多酚組成成分的HPLC色譜圖見圖4a,圖4b為同等色譜條件下16種多酚標品混合溶液的HPLC色譜圖。

由圖4a、圖5b根據(jù)單酚出峰的位置進行分析,可知新疆紅肉蘋果多酚中主要檢測出了10種單酚類物質(zhì),各成分的具體含量見表3,從表中可以看出,新疆紅肉蘋果多酚中含量最高的為綠原酸,含有(123.15±4.34) μg/mL,其次是槲皮苷和原花青素B2。根據(jù)文獻[19-20]可知,和其它白肉蘋果中多酚相比,新疆紅肉蘋果多酚中綠原酸和原花青素B2含量相對較高,兒茶素含量較低。

圖4 純化后新疆紅肉蘋果多酚與多酚標準品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of red-flesh apple polyphenols after purification and polyphenols stanfards注：a:蘋果多酚HPLC色譜圖;b:多酚標準品的HPLC色譜圖;1-原兒茶酸;2-表沒食子兒茶素;3-兒茶素;4-原花青素B2;5-綠原酸;6-對羥基苯甲酸;7-蘆丁;8-金絲桃苷;9-槲皮苷;10-槲皮素。

表3 純化后新疆紅肉蘋果多酚的單體酚種類及含量Table 3 Composition and content of individual phenolic compounds in red-flesh apple polyphenols after purification

2.3 新疆紅肉蘋果多酚的抗氧化活性

2.3.1 新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用 新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用如圖5a所示。從圖5a中可以看出,新疆紅肉蘋果多酚和VC對DPPH自由基均具有明顯的清除作用,并且隨著劑量濃度的增大而增大。當濃度為0.1 mg/mL時,二者的清除率分別高達93.99%和98.23%,隨后濃度增大,清除率變化不明顯,趨于穩(wěn)定。試驗顯示,新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基的清除作用稍弱于VC,可能是因為多酚的純度比VC低。

2.3.2 新疆紅肉蘋果多酚對羥基自由基的清除作用 按照1.2.5.2的方法進行試驗,新疆紅肉蘋果多酚對羥基自由基的清除作用如圖5b所示。從圖5b可以看出VC和新疆紅肉蘋果多酚對羥基自由基均具有很強的清除作用,且清除率隨著濃度的增大而升高,表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性。當濃度為0.8 mg/mL時,二者趨于穩(wěn)定,清除率基本相同,均達到99%以上。當濃度小于0.2 mg/mL時,新疆紅肉蘋果多酚的清除率甚至要高于VC。

2.3.3 新疆紅肉蘋果多酚對超氧陰離子的清除作用 按照1.2.5.3的方法進行試驗,新疆紅肉蘋果多酚對超氧陰離子的清除作用如圖5c所示。多酚和VC一樣可以清除NADH與NBT反應(yīng)產(chǎn)生的超氧陰離子,從而減少超氧陰離子與PMS反應(yīng)產(chǎn)生的顯色物質(zhì),使得溶液的吸光值發(fā)生改變。從圖5c中可以看出,VC和新疆紅肉蘋果多酚對超氧陰離子具有很強的清除能力,且濃度和清除率呈正相關(guān),表現(xiàn)出顯著的劑量依賴性,隨后逐漸趨于穩(wěn)定。濃度較低時,同等濃度下新疆紅肉蘋果多酚的清除率略強于VC,當達到0.4 mg/mL時,二者清除超氧陰離子的能力基本相當,均達到98%以上。

2.3.4 新疆紅肉蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用 多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制作用試驗結(jié)果如圖5d所示。從圖5d可以看出,VC和新疆紅肉蘋果多酚對脂質(zhì)的過氧化均具有較強的抑制作用,并且兩者均表現(xiàn)出劑量依賴性,即隨著濃度的升高,抑制作用顯著增強。在濃度為0.2 mg/mL時,VC的清除率逐漸趨于穩(wěn)定,多酚濃度達到0.6 mg/mL時,多酚的清除率也趨于穩(wěn)定,最終二者的清除作用逐漸相近,分別達到96.65%和93.75%。

圖5 新疆紅肉蘋果多酚的抗氧化活性試驗結(jié)果Fig.5 The antioxidant activity test results of polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a:新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基的清除率;b:新疆紅肉蘋果多酚對羥基自由基的清除率;c:新疆紅肉蘋果多酚對超氧陰離子的清除;d:新疆紅肉蘋果多酚對脂質(zhì)過氧化的抑制率。

3 討論

前人研究[23-25]發(fā)現(xiàn)AB-8型樹脂純化嘎啦蘋果多酚的效果較好,且對葡萄籽多酚有良好純化作用,D101樹脂對石榴皮多酚的有較強的吸附作用,HZ2806大孔樹脂純化茶樹花多酚其純度提高快,樟子松松塔多酚用D4020大孔樹脂純化效果好,而本試驗發(fā)現(xiàn)NKA-II樹脂紅肉蘋果多酚的吸附和解析都比較好,說明不同來源的多酚由于組成的差異其適于純化的樹脂也不同。因為不同型號的大孔樹脂孔徑和結(jié)構(gòu)差異大,能與不同的多酚成分形成分子間作用力,從而達到吸附分離的作用。盡管本試驗通過優(yōu)化多酚純化條件,使紅肉蘋果多酚的純度達到84%能滿足商業(yè)應(yīng)用的要求,但是對于深入評價紅肉蘋果多酚的細胞活性而言,其純度還不夠。其次是試驗已經(jīng)明確紅肉蘋果多酚中的主要10個成分,且體外抗氧化試驗雖已說明新疆紅肉蘋果多酚具有很好的抗氧化活性,但是紅肉蘋果多酚是否能增強體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活性、提高機體抗氧化的能力等方法,還需要繼續(xù)進行體內(nèi)抗氧化試驗(動物實驗)加以確定,這對于開發(fā)具有減少體內(nèi)氧化損傷、延緩細胞衰老、預(yù)防許多慢性病的功能食品具有重要意義。

4 結(jié)論

通過比較5種不同的大孔樹脂選取了吸附和解析性能好的NKA-II樹脂對新疆紅肉蘋果多酚進行純化,該樹脂分別在6和10 h達到靜態(tài)吸附和解析平衡;NKA-II樹脂純化多酚的動態(tài)最優(yōu)工藝為：上樣濃度0.8 mg/mL,上樣流速4.0 BV/h,上樣體積3.5 BV,洗脫液乙醇的濃度75%。在此條件下,純化后的新疆紅肉蘋果多酚其純度由35%提高至84%。

利用高效液相色譜分析純化后的新疆紅肉蘋果多酚,可知主要含有10種單酚類物質(zhì),分別為原兒茶酸、表沒食子兒茶素、兒茶素 、原花青素B2、綠原酸、對羥基苯甲酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷和槲皮素。其中綠原酸的含量最高,為123.15 μg/mL,其次是槲皮苷和原花青素B2,分別是25.28和21.96 μg/mL。

新疆紅肉蘋果多酚對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子具有明顯的清除作用,清除率與相同濃度的VC的清除率接近或高于VC,且對脂質(zhì)過氧化具有抑制作用,說明新疆紅肉蘋果多酚具有顯著的抗氧化功效。新疆紅肉蘋果多酚是一種潛在的天然抗氧化活性的功能食品基料,值得深入開發(fā)利用。