陳笑釵，李婷，黃炳文，蔣予箭*

(1.浙江五味和食品有限公司，浙江 湖州 313213； 2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018)

浙江玫瑰米醋因色澤艷如玫瑰而得名，傳統(tǒng)工藝采用固態(tài)糖化和表面靜置液態(tài)發(fā)酵，其酸味柔和綿長，鮮而微甜，醋香純正。存在發(fā)酵周期長、機械化程度低、生產(chǎn)效率不足等問題。傳統(tǒng)玫瑰醋釀造中，醋酸的形成主要在表面靜置發(fā)酵的醋酸發(fā)酵階段[1]，也是玫瑰醋色澤及風(fēng)味的主要形成時期，同時各種醇類、有機酸、酯類等呈味物質(zhì)也在此階段生成[2]。包括前期糖化、酒精發(fā)酵在內(nèi)的整個發(fā)酵時間持續(xù)120 d左右，酸度達4.5～5.0 g/dL，縮短發(fā)酵時間提高發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化率、保持特色風(fēng)味是目前玫瑰醋工藝改良的方向。以補料發(fā)酵應(yīng)用于浙江玫瑰醋傳統(tǒng)工藝的醋酸多菌種混合發(fā)酵過程中，可以控制中間代謝，避免發(fā)酵中因糖量過多造成菌體大量生長，提高底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率[3]。根據(jù)玫瑰醋生產(chǎn)中涉及的發(fā)酵工程原理，補料途徑主要流程見圖1。

圖1 補料途徑流程圖Fig.1 Flow chart of fed-batch pathway

目前將補料技術(shù)應(yīng)用在食醋釀造領(lǐng)域的理論研究和生產(chǎn)實踐的相關(guān)報道較少，主要應(yīng)用于產(chǎn)高醋酸的深層液態(tài)發(fā)酵醋。熊賢平等[4]研究了高酸度飲料用蘋果醋的分割補料釀造工藝，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵菌種耐受初始酒精濃度與醋酸濃度分別不宜超過6.5%(V/V)和3.0 g/dL，確定須采用分割體積補料發(fā)酵方式才能獲得總酸≥7.0 g/dL飲料用蘋果醋。張陽等[5]采用亞甲基藍還原法研究了酒精分批發(fā)酵過程中的酵母活力，以確定最佳補料時間，旨在為木薯等淀粉質(zhì)原料的補料發(fā)酵提供理論依據(jù)。

本文在玫瑰醋經(jīng)過糖化階段和酒化基本完成的發(fā)酵過程后，對浙江玫瑰醋的醋酸發(fā)酵階段進行補料，從補料時間、補料量、補料次數(shù)、發(fā)酵溫度的工藝條件出發(fā)，保持恒定總體積發(fā)酵，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心響應(yīng)面法對玫瑰醋醋酸發(fā)酵的補料工藝參數(shù)進行優(yōu)化[6-8]，以期得到最佳補料發(fā)酵工藝，為提高生產(chǎn)效率提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 黃酒發(fā)酵醪液(補料用)

酒精度14%～16%(V/V)，糖度5%～8%，總酸0.2～0.3 g/dL，發(fā)酵時長7 d左右，湖州老恒和釀造有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 菌種

暫名為HZ03，于2016年6月從傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋生產(chǎn)車間的表層發(fā)酵醪中分離篩選得到，30 ℃培養(yǎng)48 h，由其形態(tài)可知為醋酸桿菌，產(chǎn)酸速率為(0.063±0.002) g/dL·h，由本校生物工程系發(fā)酵實驗室保存；擴培培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉1%，取50 mL分裝到200 mL的三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，使用前加入3%無水乙醇[9]。

1.1.3 玫瑰醋液態(tài)發(fā)酵醋醪液

經(jīng)固態(tài)糖化15 d后沖缸放水，發(fā)酵至一定初始酸度的醪液，湖州老恒和釀造有限責(zé)任公司提供。

1.1.4 其他

葡萄糖、酵母粉、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、酚酞：均為分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

AR-2140型電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；SPX-250B-Z型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表有限公司；pHS-3C型酸度計 梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺、YXQ-LS-SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 玫瑰醋的補料發(fā)酵工藝

1.3.1.1 醋酸菌的擴大培養(yǎng)

接種的菌種HZ03，不氧化醋酸，發(fā)酵液香味柔和。將保存菌種接種到擴大培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，用無菌生理鹽水稀釋，使其在波長600 nm處的OD值為0.5[10]，按10%的比例添加到發(fā)酵培養(yǎng)液中。

1.3.1.2 醋酸發(fā)酵的補料操作

將傳統(tǒng)玫瑰醋發(fā)酵醪液酒精發(fā)酵基本結(jié)束后，接入10%醋酸菌，總裝液量為200 mL/L，保持控制溫度為30 ℃。當發(fā)酵進行到一定階段后，每隔一定時間放出一定體積的發(fā)酵液，然后補入等體積的后發(fā)酵黃酒補液(初始酒精度調(diào)整為6%)，然后蓋上6層紗布，不僅保證醋酸菌好氧發(fā)酵的環(huán)境，而且可以防止其他雜菌污染，如此反復(fù)發(fā)酵。過程中主要涉及的反應(yīng)方程式為：

1.3.1.3 玫瑰醋補料工藝參數(shù)優(yōu)化路線

1.3.2 玫瑰醋發(fā)酵工藝的單因素試驗

選取補料時間(底液初始酸度達到0.5,1.5,2.5,3.5,4.5 g/dL)、補料體積分數(shù)(33%、50%、67%)、補料次數(shù)(1,2,3,4,5次)和發(fā)酵溫度(26,28,30,32,34 ℃)4個因素，測定醋酸發(fā)酵基本結(jié)束時，玫瑰醋補料能達到的最高酸度。

1.3.3 玫瑰醋補料發(fā)酵工藝的Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響較為明顯的單因素為自變量，以發(fā)酵最高酸度為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計中的Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，采用Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面設(shè)計軟件進行試驗設(shè)計，共進行17組實驗，每組實驗重復(fù)測定3次，最后確定最佳優(yōu)化條件。Box-Behnken中心組合設(shè)計的因素水平及編碼水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計的因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.3.4 測定方法

1.3.4.1 酒精度測定

采用蒸餾法，參照GB/T 13662-2008進行分析。

1.3.4.2 酸度測定[11]

采用酸堿滴定法，在燒杯中準確吸取1 mL樣品，加80 mL蒸餾水，在磁力攪拌器上攪拌均勻，邊攪拌邊用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH 8.20為止，對消耗的NaOH體積數(shù)進行讀數(shù)。平行測定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 補料時間點對玫瑰醋醋酸發(fā)酵的影響

圖2 不同補料時間點對醋酸發(fā)酵過程總酸生成的影響Fig.2 Effect of different fed-batch time on total acid production during acetic acid fermentation

補加時間過早，補加酒液使原料中酒精含量過高而抑制醋酸菌的生長及代謝[12]。由圖2可知，隨補料時間點延后，醋酸發(fā)酵結(jié)束時的最高產(chǎn)酸量先升高后降低。因為在低初始醋酸濃度下補料，有利于醋酸菌的生長，與傳統(tǒng)發(fā)酵過程對比，提高了其產(chǎn)酸能力，趙會芳、亓元正、高曉娟[13-15]都發(fā)現(xiàn)，初始酸度1.0 g/dL時對菌體產(chǎn)酸速率有明顯促進作用，為了充分發(fā)揮醋酸菌的產(chǎn)酸活性，保持一定低濃度的初始醋酸底物很有必要。而補料時間太遲，發(fā)酵液中酒精消耗，有毒(害)代謝物質(zhì)開始積累，醋酸菌出現(xiàn)衰亡。在初始酸度3.5 g/dL時補料，最終產(chǎn)酸量達到最高(4.88±0.35) g/dL。因此，按發(fā)酵液酒精度不再上升，醋酸發(fā)酵至不同初始酸度(1.5,2.5,3.5 g/dL)為響應(yīng)面的取值范圍。

2.2 補料量對玫瑰醋醋酸發(fā)酵的影響

圖3 不同補料量對醋酸發(fā)酵過程總酸生成的影響Fig.3 Effect of different fed-batch amount on total acid production during acetic acid fermentation

以發(fā)酵底液初始酸度達到1.5 g/dL為補料時間點，改變補料體積，考察醋酸發(fā)酵結(jié)束時可生成的總酸量。由圖3可知，3個不同補料量均能提高產(chǎn)酸量，可用來進行響應(yīng)面分析。經(jīng)過預(yù)實驗，在一定補料體積范圍內(nèi)，少量補料能加快醋酸發(fā)酵進程，有利于酒精轉(zhuǎn)化為醋酸；補料量增加，酒精醪液補充過多，酒精濃度過高，反而會抑制醋酸菌的生長。故補料體積選擇33%、50%、67%較為合適。

2.3 補料次數(shù)對玫瑰醋醋酸發(fā)酵的影響

圖4 不同補料次數(shù)對醋酸發(fā)酵過程總酸生成的影響Fig.4 Effect of different fed-batch times on total acid production during acetic acid fermentation

選擇補料量為50%后，分不同次數(shù)將黃酒后發(fā)酵液補加進醋酸發(fā)酵醪繼續(xù)發(fā)酵，探究不同補料次數(shù)對醋酸發(fā)酵過程最終總酸量生成的影響。由圖4可知，補料0次即為傳統(tǒng)發(fā)酵對照，補料1次最終能達到的最高酸度比較高，且隨著補料次數(shù)的增加，總酸生成量越低。可能原因是，玫瑰醋生產(chǎn)采用表面液態(tài)發(fā)酵，在空氣及液體交界處形成菌體大量集中的細菌纖維素膜，有助于耗氧代謝及傳質(zhì)，要盡量保證發(fā)酵表面菌膜的完整性，發(fā)酵才能順利進行，短時間內(nèi)補料多次不利于表面菌膜的形成和醋酸菌的富集，醋酸生成量受到影響。結(jié)果表明，醋酸發(fā)酵中補酒液1次可以提高最終產(chǎn)酸量，補料次數(shù)增加反而影響醋酸的生成。

2.4 發(fā)酵溫度對玫瑰醋醋酸發(fā)酵的影響

圖5 不同發(fā)酵溫度對補料發(fā)酵酸度變化的影響Fig.5 Effect of different fermentation temperatures on fed-batch fermentation acidity

溫度不僅直接影響由乙醇轉(zhuǎn)變成乙酸的生物氧化速度，而且會影響發(fā)酵副產(chǎn)物的代謝平衡，間接影響玫瑰醋芳香物質(zhì)的形成和口感，所以在發(fā)酵參數(shù)的控制中要對溫度重點關(guān)注[16，17]。以不同的發(fā)酵溫度(26，28，30，32，34 ℃)研究，其中28 ℃基本接近研究環(huán)境的常溫，底料初始酸度達到2.5 g/dL、補料量為1/2體積的條件下，由圖5可知，在26～32 ℃條件下，隨發(fā)酵溫度的上升，酸度明顯上升，26 ℃時發(fā)酵前6 d酸度上升緩慢，之后上升但酸度明顯低于其他組，表明溫度過低，醋酸菌生長緩慢，無法將酒精及時發(fā)酵為醋酸。30 ℃和32 ℃能達到的最高酸度較其他溫度要高，顯然在一定溫度范圍內(nèi)，醋酸菌的生長繁殖隨溫度的上升而增加。當溫度上升到34 ℃時，醋酸菌的生長代謝會受到高溫影響，產(chǎn)酸效率降低，另外，隨著溫度的升高，酒精的揮發(fā)程度加重，這也會導(dǎo)致醋酸菌對酒精利用率的下降。因此，選擇28，30，32 ℃進行響應(yīng)面分析較為合適。

發(fā)酵溫度對最高酸度的影響曲線見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對最高酸度的影響曲線Fig.6 Curve of the effect of fermentation temperature on the maximum acidity

2.5 Box-Behnken中心響應(yīng)面法優(yōu)化補料發(fā)酵參數(shù)

2.5.1 補料發(fā)酵響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析

通過探究4個單因素(補料時間點、補料量、補料次數(shù)、發(fā)酵溫度)對玫瑰醋醋酸形成的影響，選擇補料時間點(初始酸度達到1.5，2.5，3.5 g/dL)、補料量(33%、50%、67%)、發(fā)酵溫度(28，30，32 ℃)進行三因素三水平的響應(yīng)面模型設(shè)計及參數(shù)優(yōu)化。

利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 浙江玫瑰醋的補料發(fā)酵最優(yōu)補料條件響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test for optimal fed-batch fermentation conditions of Zhejiang rose vinegar

對表2的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，對響應(yīng)值進行回歸分析后建立玫瑰醋醋酸發(fā)酵過程補料工藝的參數(shù)回歸模型，回歸方程為：

Y=4.93+0.25A-0.044B+0.12C-0.09AB+0.3AC-0.18BC-0.61A2-0.15B2-0.21C2。

為了驗證玫瑰醋補料發(fā)酵工藝的參數(shù)回歸模型的可靠性，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 玫瑰醋補料工藝條件回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model for fed-batch process conditions of rose vinegar

注：P<0.01表示差異極顯著，用“**”表示；P<0.05表示差異顯著，用“*”表示；P>0.05表示差異不顯著。

由表3可知，模型極顯著(P<0．001)，失擬值不顯著(P>0．05)，說明該回歸方程的擬合效果好，此外變異系數(shù)(C.V.，%)為1.74%，相對較低的值也表明模型具有更好的精度，試驗設(shè)計方案具有可操作性。二次項A2、B2、C2顯著，說明對響應(yīng)值有極顯著影響。A，B，C 3個因素對響應(yīng)值的影響效果大小為：A>C>B。R2為0.9754>0.9，說明此模型具有可靠性，RAdj2=0.9438，說明此模型可以解釋大約94.38%響應(yīng)值的變化，因此回歸方程的擬合程度較好。所以試驗結(jié)果與預(yù)測值之間具有良好的擬合度，可以用此參數(shù)回歸模型來對玫瑰醋的補料發(fā)酵過程進行分析和預(yù)測。

2.5.2 補料發(fā)酵參數(shù)響應(yīng)面及等高線分析

響應(yīng)表面圖用于研究兩因素之間的相互作用對于醋酸發(fā)酵過程最終產(chǎn)酸量的影響。三維(3D)響應(yīng)面預(yù)測模型和二維輪廓圖見圖7。

輪廓圖的形狀近似橢圓形，表明初始酸度與補料量之間相互作用顯著。初始酸度和發(fā)酵溫度交互作用顯著，由圖7可知，隨著補料初始酸度的增大，補料量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；隨著補料量的增加，發(fā)酵溫度略微上升；隨著初始酸度的增大，發(fā)酵溫度呈增大的趨勢。

圖7 補料時間、補料量和發(fā)酵溫度的交互作用對最高產(chǎn)酸量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fed-batch time, fed-batch volume and fermentation temperature on the maximum acid yield

基于以上實驗數(shù)據(jù)，該模型預(yù)測在最佳工藝條件下，玫瑰醋補料發(fā)酵可提高產(chǎn)酸量最高達到5.55 g/dL：補料初始酸度達到2.85 g/dL，補料量33%，發(fā)酵溫度32 ℃。在最佳條件下進行5個平行實驗，驗證模型的充分性，最高酸度達到(5.59±0.27) g/dL，與預(yù)測數(shù)據(jù)吻合良好。

3 結(jié)論

本研究以補料發(fā)酵工藝用于浙江玫瑰醋傳統(tǒng)工藝的改良，采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法優(yōu)化補料發(fā)酵工藝參數(shù)，得出最佳工藝參數(shù)為：補料時間在底液初始酸度達到2.85 g/dL，補料體積為33%，控制發(fā)酵溫度為32 ℃，補料次數(shù)對最終產(chǎn)酸量影響不顯著，為提高效率，選擇一次補料，此時醋酸發(fā)酵結(jié)束時，玫瑰醋最高產(chǎn)酸量為(5.59±0.27) g/dL，其感官、理化指標和微生物指標都接近傳統(tǒng)發(fā)酵玫瑰醋。

通過對玫瑰醋補料發(fā)酵工藝的研究，探索不同發(fā)酵條件對發(fā)酵進程的影響，為補料發(fā)酵用于改良玫瑰醋生產(chǎn)的研究，為后續(xù)工廠中試縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率提供了理論基礎(chǔ)。研究此方法在玫瑰米醋生產(chǎn)中的可行性，可實現(xiàn)一年四季均能連續(xù)生產(chǎn)，不受季節(jié)限制，為后續(xù)借鑒黃酒機械化連續(xù)蒸飯、糖化、酒精發(fā)酵，建立浙江玫瑰米醋機械化生產(chǎn)線提供了理論依據(jù)。