付彬，沈婉瑩，周夢舟，吳茜，徐寧

(湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068)

柑橘是世界第一大水果[1]，根據(jù)國家統(tǒng)計局最新數(shù)據(jù)顯示，2017年全國柑桔產(chǎn)量約為3817萬噸，湖北省柑橘產(chǎn)量居第四位，達466萬噸，柑橘在加工過程中約產(chǎn)生20%～50%的皮渣，然而皮渣的利用率卻不足10%。傳統(tǒng)加工業(yè)將這些副產(chǎn)物填埋處理或生產(chǎn)加工成動物飼料[2，3]。皮渣極易霉變發(fā)臭，填埋處理會對環(huán)境造成嚴重污染，而加工飼料通常需干燥處理，耗費大量的能源[4]。

柑橘皮中富含精油、色素、纖維素、果膠、木質(zhì)素、黃酮類化合物等，具有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、治療腸道疾病、維持血管滲透壓、降低血管脆性等作用[5]。

柑橘皮渣開發(fā)利用的一個主要途徑是圍繞其所含成分的提取而展開的，另一個主要途徑是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)果醋、乳酸飲料、高蛋白飼料和栽培食用菌。運用生物技術(shù)對其進行轉(zhuǎn)化，將各種優(yōu)良的微生物菌種運用到柑橘皮的綜合利用中，將是解決柑橘皮渣利用的根本出路[6，7]。本實驗采用米曲霉和黑曲霉兩種曲霉分別發(fā)酵柑橘皮，獲得柑橘皮發(fā)酵汁，并研究了其抗氧化活性和揮發(fā)性風味物質(zhì)，為探索柑橘皮微生物發(fā)酵產(chǎn)品的功能營養(yǎng)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS3.951(滬釀3.042)、黑曲霉(AspergillusnigerHG-35)：以上菌種均保藏于湖北工業(yè)大學湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；溫州蜜柑(Citrusunshiu)：湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)股份有限公司提供。福林酚、DPPH、TPTZ等試劑：購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

WFJ2000紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器設備有限公司；AB-50電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；GC-MS 5975-7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

接種 18%鹽水

↓ ↓

柑橘皮→蒸煮、滅菌→冷卻→添加面粉→混合均勻→制曲→成曲→發(fā)酵→成品。

柑橘皮清潔處理后,于115 ℃蒸壓20 min,冷卻后拌入面粉(橘皮∶面粉為4∶1)并接入米曲霉0.5%，拌勻。制曲32 ℃培養(yǎng)40 h后將曲料裝于發(fā)酵罐中，并向發(fā)酵罐中注入2倍質(zhì)量的18%鹽水，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵。

1.3.2 總黃酮的測定

采用比色法進行測定[8]。吸取適量經(jīng)稀釋后的柑橘皮發(fā)酵汁，加入0.3 mL 亞硝酸鈉溶液(5%，W/V)反應5 min，之后加入0.3 mL硝酸鋁溶液(10%，W/V)，充分混勻后靜置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉，之后定容至10 mL。在510 nm處測定吸光值。選取0，0.1，0.2，0.3， 0.4，0.5，0.6 mg/mL的蘆丁作為標準品繪制標準曲線。每毫升柑橘皮發(fā)酵汁中總黃酮含量用蘆丁當量RE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.3 總多酚的測定

采用福林酚方法[9]。吸取適量經(jīng)稀釋后的柑橘皮發(fā)酵汁與5 mL稀釋的福林酚溶液(10%，V/V)混合，搖勻后加入2 mL碳酸鈉溶液(15%，W/V)，用蒸餾水補充至10 mL，充分搖勻，在黑暗條件下室溫顯色反應1 h，最后在760 nm處測定吸光值。選取0，10，20，40，60，80 μg/mL的沒食子酸作為標準品制作標準曲線。每1 mL柑橘皮發(fā)酵汁中總多酚含量以沒食子酸當量GAE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考Hsiao等人的試驗方法測定DPPH自由基的清除能力。具體方法如下：取0.2 mL稀釋適當倍數(shù)的發(fā)酵汁，加入3.8 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分搖勻，黑暗條件下靜置30 min，然后使用紫外可見光分光光度計測定各樣品在517 nm處的吸光值，調(diào)零為0.2 mL去離子水和3.8 mL乙醇，對照為0.2 mL稀釋適當倍數(shù)的發(fā)酵汁和3.8 mL乙醇，空白為0.2 mL去離子水和3.8 mL DPPH溶液。選取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μmol/L的水溶性維生素E作為標準品繪制標準曲線。每毫升發(fā)酵汁中DPPH自由基清除能力用水溶性維生素E當量μmolTE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.4.2 亞鐵離子還原能力的測定

亞鐵離子還原能力(FRAP)參考Granato等的方法[10]，具體方法如下：精確吸取100 μL稀釋樣品，在37 ℃下預熱2 min，同樣加入已在37 ℃下預熱的FRAP工作液(300 mmol/L pH 3.6的乙酸鈉緩沖液∶10 mmol/L TPTZ∶20 mmol/L六水合氯化鐵為10∶1∶1 (V/V/V) 3 mL，再加入300 μL去離子水，然后混勻反應4 min，用紫外可見分光光度計測定樣品在593 nm處的吸光值?？瞻自噭┱{(diào)零。選取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的七水合硫酸亞鐵來繪制標準曲線。每毫升發(fā)酵汁中FRAP用亞鐵離子當量μmolFE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定參照康明麗等的方法[11]。

樣品處理：均勻取樣品9 mL于25 mL螺旋進樣瓶中, 加入3 g 氯化鈉, 用聚四氟乙烯隔墊密封；攪拌平衡30 min,平衡溫度為40 ℃；平衡后將SPME纖維萃取頭經(jīng)隔墊插入進樣瓶，插入深度為1 cm，推出纖維頭，頂空吸附30 min；取出萃取頭插入GC進樣口，推出纖維頭，解吸5 min后進行GC-MS分析。

GC條件：HP-5MS色譜分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(1.0 mL/min)；分流比為5∶1；升溫程序：起始柱溫40 ℃保持 2 min，以5 ℃/min的速率升到120 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子轟擊能量為70 eV；離子掃描范圍為33～350 m/z，掃描速度為3.00 scans/s，離子源溫度為250 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮與總多酚含量

2.1.1 總黃酮含量

黃酮類化合物是一類存在于自然界并具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物[12]。柑橘皮渣中含有大量的黃酮類化合物。黃酮具有清除自由基、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤等功能[13-15]。黃酮類化合物在醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣闊的應用前景。

柑橘果皮中黃酮類化合物的種類與總含量高于果肉[16]。接種不同曲霉得到的柑橘皮發(fā)酵汁中總黃酮含量見圖1。

圖1 柑橘皮發(fā)酵汁中總黃酮含量Fig.1 Content of total flavonoids in citrus peel fermented juice

由圖1可知，對照組、接種黑曲霉和米曲霉后柑橘皮發(fā)酵汁的總黃酮含量分別為57.54，74.43，62.83 μgRE/mL。接種黑曲霉的柑橘發(fā)酵汁中總黃酮含量最高，總黃酮含量比對照組增加了29.34%。接種米曲酶后得到的發(fā)酵汁中總黃酮含量比對照組增加了9.19%。

2.1.2 總多酚含量

柑橘中植物化學素種類繁多，特別是酚類物質(zhì)含量豐富，包括酚酸和類黃酮兩類植物多酚，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等多種活性功能[17]。接種不同曲霉獲得的柑橘皮發(fā)酵汁總多酚含量見圖2。

與對照組相比，接種黑曲霉和米曲霉發(fā)酵明顯增加了總多酚含量，含量分別為2.80，5.94 mgGAE/mL，分別提高了49.39%、217.02%。接種米曲霉的發(fā)酵汁中總多酚含量約為接種黑曲霉的2倍。

圖2 柑橘皮發(fā)酵汁中總多酚含量Fig.2 Content of total polyphenols in citrus peel fermented juice

2.2 抗氧化活性

自由基是引起癌癥、衰老、心血管等退變性疾病的罪惡之源。自由基在體內(nèi)可直接或間接地發(fā)揮強氧化劑作用而與機體內(nèi)核酸、核蛋白和脂肪酸相結(jié)合, 轉(zhuǎn)變成氧化物或過氧化物, 使之喪失活性或變性, 細胞功能發(fā)生障礙, 引起機體逐漸衰老或病變[18-20]。Sadik等[21]的研究表明黃酮類化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。接種不同曲霉獲得的柑橘發(fā)酵汁中抗氧化活性見圖3。

圖3 柑橘皮發(fā)酵汁中抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of citrus peel fermented juice

FRAP法和DPPH法測得的抗氧化活性變化趨勢相同。接種曲霉后柑橘發(fā)酵汁的抗氧化活性明顯增強。接種黑曲霉的發(fā)酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性分別為4.163 μmolTE/mL、8.044 μmolFE/mL，比對照組分別提高了10.19%、38.34%。接種米曲霉的發(fā)酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性高于黑曲霉發(fā)酵，分別為6.257 μmolTE/mL、12.016 μmolFE/mL，比對照組分別提高了65.65%、106.64%。

2.3 揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

對發(fā)酵第50天的柑橘皮發(fā)酵汁中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析(見表1)，從柑橘皮發(fā)酵汁中共鑒定出66種揮發(fā)性物質(zhì)，對照組、接種黑曲霉和米曲霉制得的柑橘皮發(fā)酵汁分別鑒定出29，49，44種揮發(fā)性物質(zhì),接種曲霉后可明顯增加揮發(fā)性物質(zhì)的種類，其中包括烯烴類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類、芳香烴類以及其他化合物。

表1 柑橘皮發(fā)酵汁中揮發(fā)性物質(zhì)成分及相對含量Table 1 Volatile compounds and relative content in citrus peel fermented juice

續(xù) 表

注：“—”表示未檢測出。

柑橘皮發(fā)酵汁中揮發(fā)性物質(zhì)主要以烯烴類化合物和醇類化合物為主。3種發(fā)酵汁中均檢測出蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、杜松烯、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、芳樟醇、(-)-4-萜品醇、松油醇、2-環(huán)己烯-1-醇、香茅醇、乙酸香茅酯、乙酸橙花酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、香芹酮、對乙烯基愈瘡木酚、呋喃甲醛、苯甲醛17種揮發(fā)性成分。其中包括4種烯烴類物質(zhì)、6種醇類物質(zhì)、3種酯類物質(zhì)、1種酮類物質(zhì)、1種酚類物質(zhì)和2種醛類物質(zhì)。蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、羅勒烯、α-石竹烯、杜松烯、芳樟醇、松油醇、香茅醇、乙酸香葉酯、香芹酮11種柑橘中主要的香氣化合物在接種黑曲霉和接種米曲霉的柑橘發(fā)酵汁中均被檢測出來，其相對含量分別為77.2%、90.23%。說明接種黑曲霉和接種米曲霉的發(fā)酵汁中的揮發(fā)性成分與柑橘中主要香氣成分有部分相同，但是含量有差別。

烯烴類化合物相對含量均達到70%以上，D-檸檬烯含量最高，其中接種米曲霉的發(fā)酵汁中D-檸檬烯相對含量高達77.09%。D-檸檬烯對光和熱均不穩(wěn)定, 易被空氣中的氧氣氧化成有異味的香芹酮[22]。柑橘鮮汁和加工汁儲藏60 d后，其中檸檬烯的含量都減少47%[23]。利用橘皮發(fā)酵較好地保存了橘皮中的檸檬烯。同時，接種黑曲霉后，柑橘皮在自體酶和黑曲霉產(chǎn)酶條件下發(fā)酵催化，將D-檸檬烯轉(zhuǎn)化成癸醛、芳樟醇和α-萜烯醇(香茅醇、金合歡醇、4-萜烯醇等), 從而明顯提高了柑橘皮發(fā)酵汁的香氣品質(zhì)[24]，使其具有獨特的甜香味、松油香味、丁香味、玫瑰香味以及薄荷香味。

接種黑曲霉和接種米曲霉后相比對照組都新增的揮發(fā)性風味物質(zhì)有：羅勒烯、α-萜品烯、α-蒎烯、β-欖香烯、1-石竹烯、(+)-香橙烯、α-石竹烯、4，7-甲基丙烯、α-法尼烯、(-)-g-蓽澄茄烯、苯乙醇、紫蘇醇、乙酸香葉酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、蓽澄茄油萜、異亮氨酸16種，可見接種黑曲霉和米曲霉可明顯增加柑橘皮發(fā)酵汁中揮發(fā)性風味物質(zhì)的產(chǎn)生。其中，接種黑曲霉的柑橘皮發(fā)酵汁中相較對照組和接種米曲霉組增加了2-蒈烯、別羅勒烯、2-呋喃甲醇等15種揮發(fā)性物質(zhì)。接種黑曲霉的柑橘皮發(fā)酵汁中風味物質(zhì)的種類豐富，其醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物和酚類化合物種類明顯高于其他兩組，且相對含量高。

3 總結(jié)

本研究利用新鮮柑橘皮、面粉等為主輔原料進行微生物發(fā)酵，設置了對照組、接種黑曲霉、接種米曲霉3組實驗，得出接種米曲霉后可明顯提高柑橘皮發(fā)酵汁的抗氧化活性，其DPPH·清除能力提高了65.65%，F(xiàn)RAP活性提高了106.64%，均是接種黑曲霉的柑橘發(fā)酵汁的1.5倍。檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)數(shù)量分別為29，49，44種，以烯烴類物質(zhì)為主，其次是醇類物質(zhì)。接種曲霉可明顯增加揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類，明顯提高了柑橘皮發(fā)酵汁的香氣品質(zhì)。檢測出接種黑曲霉和米曲霉的發(fā)酵汁中揮發(fā)性風味物質(zhì)數(shù)量略有差異，但種類和相對含量有明顯區(qū)別。