劉 念 于祥遠(yuǎn) 秦林原 張 軍 余紅平,3

(1 桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)流行病學(xué)教研室，廣西桂林市 541004，電子郵箱：498106735@ qq.com；2 上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市 200092；3 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤科，南寧市 530021)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是最常見的妊娠并發(fā)癥之一，其在我國的發(fā)病率為6.8%～10.4%[1-2]。GDM可導(dǎo)致孕婦妊娠期間發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓、羊水過多、糖尿病酮癥酸中毒等情況，并增加產(chǎn)后發(fā)生2型糖尿病及其他慢性疾病的風(fēng)險，也可導(dǎo)致巨大胎兒、胎兒生長受限、胎兒畸形、新生兒窒息等[3]。研究表明，GDM是由環(huán)境、遺傳因素、生活方式等多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，但有關(guān)遺傳方面的病因機(jī)制尚未完全清楚[4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因組最常見的遺傳變異，被廣泛用于疾病風(fēng)險預(yù)測和預(yù)后評估等。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)顯示，胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白2基因、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN)2A/2B基因等的SNP與GDM顯著相關(guān)[5]。CDKN2A/2B可抑制周期蛋白依賴性激酶4/6的活性，從而導(dǎo)致胰島B細(xì)胞的增殖能力受損，引起拮抗胰島素樣物質(zhì)的增加，進(jìn)而導(dǎo)致GDM的發(fā)生[6]。此外，CDKN2A/2B基因rs10757261和rs2383208位點的SNP還可調(diào)控胰島B細(xì)胞的分泌功能，從而影響GDM的發(fā)生[5，7]。但是，目前有關(guān)CDKN2A/2B基因SNP與GDM發(fā)生的關(guān)系仍未完全明確。因此，本研究探討CDKN2A/2B基因的遺傳多態(tài)性與GDM的關(guān)系，以期為GDM早期診斷和防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月至2016年6月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和桂林市婦女兒童醫(yī)院于孕24～28周行定期產(chǎn)檢的孕婦1 030例。所有研究對象均行OGTT。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往患有糖尿病、高血壓、肝腎功能不全者；有其他妊娠合并癥者；近期服用影響糖代謝藥物者。根據(jù)國際妊娠合并糖尿病研究組織制定的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，1 030例孕婦中， GDM患者459例(病例組)，正常妊娠者571例(對照組)。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院和桂林市婦女兒童醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，所有對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 收集資料：收集所有研究對象入組時的臨床資料，包括年齡、身高、體重、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、OGTT后1 h血糖、OGTT后2 h血糖、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)。

1.2.2 全血基因組DNA提?。翰杉芯繉ο罂崭雇庵苎? mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：281525AX)的操作要求提取外周血DNA；應(yīng)用NanoDrop3000核酸測定儀(美國Thermo Scientific公司)檢測DNA濃度和純度，A260/A280比值在1.7～1.9為符合DNA純度要求；將符合純度要求的DNA標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 選擇候選基因SNP位點：利用美國國立衛(wèi)生研究院環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm)、美國國立生物技術(shù)信息中心SNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和國際人類基因組單體型圖數(shù)據(jù)庫(http://www.hapmap.org)等生物信息學(xué)工具，并基于GWAS與GDM相關(guān)的研究[9-10]，選擇CDKN2A/2B基因的SNP位點，所有SNP位點在中國北京漢族人群中最小等位基因頻率≥5%。應(yīng)用美國國立衛(wèi)生研究院環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所SNP Function Prediction工具選擇轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄后剪切位點、微小RNA結(jié)合位點等區(qū)域的SNP位點，經(jīng)連鎖不平衡TAG SNP Selection工具檢測，各位點需滿足連鎖不平衡系數(shù)r2<0.8。計算機(jī)檢索美國國立生物技術(shù)信息中心SNP數(shù)據(jù)庫，選擇與GDM、血糖水平、胰島B細(xì)胞功能等顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點，結(jié)合有關(guān)GWAS的研究報道[9-10]，選擇與GDM遺傳易感性存在顯著關(guān)聯(lián)(P≤1×10-7)的位點。最終篩選出CDKN2A基因rs2811710、rs3088440、rs7036656位點，CDKN2B基因rs1063192、rs3217986、rs3217992位點和CDKN2A/2B基因rs10811661位點。

1.2.4 候選SNP位點基因型檢測：利用Sequenom MassARRAY SNP分型系統(tǒng)(北京博奧生物科技有限公司)對候選SNP位點進(jìn)行基因型檢測。(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。按照反應(yīng)體系加入反應(yīng)成分，包括10 ng/μL DNA 1 μL、10×緩沖液0.5 μL、25 mmol/L氯化鎂0.4 μL、5 U/μL Taq 0.2 μL、25 mmol/L脫氧核苷三磷酸0.1 μL、20 μmol/L特異擴(kuò)增引物混合液1 μL，去離子水補足至4 μL。(2)反應(yīng)程序。94℃預(yù)變性15 min；94℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)45次；最后72℃終末延伸3 min。(3)質(zhì)譜檢測。應(yīng)用Sequenom MassARRAY系統(tǒng)制備檢測SpectroChip芯片，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行蝦堿性磷酸酶純化、單堿基延伸反應(yīng)、樹脂純化處理后，采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀(北京博奧生物科技有限公司)分析，最后采用TYPER 4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖。基因分型的檢測由北京博奧生物科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析候選SNP位點在對照組中的基因型分布頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。應(yīng)用多因素非條件Logistic回歸模型，分析各SNP位點基因型與GDM發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系，其中，分析各基因型之間及顯性模型(GA/AA、TC/CC、AG/GG或GT/GG)與隱性純合子(GG、TT、AA或TT)之間GDM發(fā)生風(fēng)險的差異，并經(jīng)年齡、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓等因素較正后，分析各SNP位點基因型與GDM發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。采用多因子降維法(分析軟件為mdr_3.0.2)分析多位點與GDM發(fā)生的交互作用。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦的臨床資料比較 病例組孕婦年齡、體質(zhì)指數(shù)、空腹血糖、OGTT后1 h血糖、OGTT后2 h血糖、HbA1c、收縮壓、舒張壓水平均高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組孕婦的臨床資料比較(x±s)

2.2 候選基因SNP位點與GDM易感性的關(guān)系 CDKN2A基因rs3088440、rs7036656位點，CDKN2B基因rs1063192、rs3217986位點和CDKN2A/2B基因rs10811661位點基因型在對照組中的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見表2；而CDKN2A基因rs2811710位點和CDKN2B基因rs3217992位點基因型在對照組中的分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.503,P<0.001；χ2=9.091，P=0.003)，不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，因此未進(jìn)一步分析其與GDM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。

多因素分析結(jié)果顯示，與攜帶CDKN2A/2B基因rs10811661位點CC基因型比較，攜帶TC或TT基因型孕婦的GDM患病風(fēng)險均升高；在顯性遺傳模型下，與CC基因型攜帶者相比，攜帶TC/TT基因型的孕婦發(fā)生GDM的風(fēng)險升高(均P<0.05)。經(jīng)年齡、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓等因素校正后，結(jié)果顯示，各候選基因SNP位點基因型與GDM發(fā)病均無關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見表2。

表2 候選SNP基因型與GDM易感性的關(guān)系[n(%)]

注：a為擬合優(yōu)度χ2檢驗結(jié)果；b為未校正的分析結(jié)果；c為校正了年齡、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓的分析結(jié)果。

2.3 候選SNP位點間的交互作用 結(jié)果顯示，最優(yōu)單位點模型為rs10811661位點(P<0.05)；SNP-SNP聯(lián)合作用與GDM發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，rs10811661-rs7036656-rs1063192-rs3217986位點的交互作用可增加GDM發(fā)生風(fēng)險(P<0.05)，交叉驗證一致性為10/10，測試平衡準(zhǔn)確性為0.4850。見表3。

表3 候選SNP位點間交互作用分析

注：其他單位點模型及交互作用分析中P>0.05，故未列出相應(yīng)結(jié)果。

3 討 論

CDKN2A/2B基因是染色體9p21上兩個鄰近的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因。CDKN2A和CDKN2B分別編碼細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p16INK4a和p15INK4b，可抑制細(xì)胞周期蛋白激酶4/6的活性，從而抑制胰島B細(xì)胞的增殖能力[6]。動物研究結(jié)果顯示，缺乏細(xì)胞周期蛋白激酶4的小鼠由于B細(xì)胞增殖能力下降以及胰島組織減少而罹患糖尿病，而細(xì)胞周期蛋白激酶4過表達(dá)的小鼠則出現(xiàn)B細(xì)胞的病理增殖[3]；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)高表達(dá)的p15INK4b與胰島發(fā)育和胰島素分泌不全有關(guān)[11]。另外，CDKN2A/2B基因的rs10757261和rs2383208位點多態(tài)性可調(diào)控胰島B細(xì)胞的分泌功能，進(jìn)而引起GDM的發(fā)生[5,7,9]。由此可見，CDKN2A/2B基因參與了胰島B細(xì)胞增殖的抑制以及功能的損傷等多個過程，從而導(dǎo)致GDM的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，CDKN2A/2B基因rs10811661位點多態(tài)性與GDM易感性存在關(guān)聯(lián)， TC和TT基因型攜帶者發(fā)生GDM的風(fēng)險分別是CC基因型攜帶者的1.416倍和1.478倍，在遺傳模型中，攜帶TC/TT基因型者發(fā)生GDM的風(fēng)險是攜帶CC基因型者的1.441倍(均P<0.05)；但經(jīng)年齡、體質(zhì)指數(shù)、收縮壓、舒張壓等因素校正后，各候選基因SNP位點基因型與GDM發(fā)病均無關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。目前，關(guān)于CDKN2A/2B基因rs10811661位點多態(tài)性與GDM遺傳易感性關(guān)系的研究結(jié)果不盡相同。一項韓國的GWAS研究顯示，CDKN2A/2B基因rs10811661位點多態(tài)性與GDM的發(fā)病顯著相關(guān)[5]；一項病例對照研究也證實，rs10811661位點多態(tài)性與GDM的發(fā)病存在相關(guān)性[12-15]。但也研究結(jié)果顯示，CDKN2A/2B基因rs10811661位點多態(tài)性與GDM遺傳易感性無關(guān)[16-18]。一項Meta分析結(jié)果表明，攜帶rs10811661位點T等位基因的孕婦發(fā)生GDM的風(fēng)險升高，而在亞洲人群和高加索人群中T等位基因攜帶者較多[19]。據(jù)此，我們推測遺傳背景的不同，導(dǎo)致不同地區(qū)或種族間的妊娠期女性對GDM的易感性存在明顯的群體差異，因此在不同人群中同一位點的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果會存在差異。

多因子降維法是一種非參數(shù)、無需考慮遺傳模式的高階交互作用分析方法，適用于多基因或與環(huán)境因素共同決定的慢性疾病的分析，如糖尿病、原發(fā)性高血壓、心房顫動等[20-21]。SNP是微小遺傳因素，可能難以檢測到單個效應(yīng)，而多因子降維法可識別多種SNP之間的交互作用，可以提高分析聯(lián)合作用對個體GDM易感性影響的效能。GDM是多基因遺傳病，因此本研究采用多因子降維法分析候選SNP位點的交互作用。結(jié)果顯示，最優(yōu)單位點模型為rs10811661位點；rs10811661-rs7036656-rs1063192-rs3217986位點的交互作用與GDM發(fā)病存在關(guān)聯(lián)(均P<0.05)。上述結(jié)果提示這些位點可能共同構(gòu)成了GDM發(fā)生的多基因異常機(jī)制。

綜上所述，CDKN2A/2B基因rs10811661位點多態(tài)性與GDM發(fā)生相關(guān)，CDKN2A/2B基因SNP位點的單獨或聯(lián)合作用均可影響妊娠期女性對GDM的易感性。本研究也存在一些不足：環(huán)境因素在GDM的發(fā)病過程中起著重要作用，但本研究未能對吸煙、膳食、運動等其他環(huán)境因素進(jìn)行控制，可能影響結(jié)果分析。今后可進(jìn)一步納入家族史、不良生育史、生活方式等因素，并在不同人群、不同地區(qū)、大樣本中進(jìn)行驗證，也可探索SNP與胰島B細(xì)胞功能性指標(biāo)的關(guān)系，在功能性實驗的支持下深入探討關(guān)聯(lián)關(guān)系和發(fā)病機(jī)制。