彭敏，張玲，羅瓊

廣元市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 廣元 628000

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，其病死率較高，嚴(yán)重威脅中國(guó)女性健康[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抗原的大量釋放會(huì)刺激機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，其中輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）為叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，主要表達(dá)于CD4＋CD5＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），可抑制Th、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及殺傷細(xì)胞作用，抑制腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[2]。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱(chēng)PD-L1）是重要的免疫抑制性分子，Merelli等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在人類(lèi)黑色素瘤中有表達(dá)，且PD-L1在腫瘤組織中表達(dá)是腫瘤預(yù)后不良的影響因素，但目前關(guān)于PD-L1與宮頸癌的關(guān)系研究甚少。本研究主要分析宮頸癌組織中FOXP3+Treg與PD-L1的表達(dá)情況及與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月至2018年5月于廣元市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的75例宮頸癌患者、38例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者及30例同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)宮頸病變的患者。所有患者均經(jīng)病理檢查并經(jīng)復(fù)檢確診，術(shù)前均未接受放化療、生物治療。宮頸癌患者中，年齡32～62歲，平均（47.18±4.93）歲；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ期 23例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期14例；組織分化程度：低分化25例，中分化32例，高分化18例。CIN患者中，年齡30～63歲，平均（47.15±4.96）歲；CIN分級(jí)：Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)14例，Ⅲ級(jí)16例。子宮肌瘤患者中，年齡31～64歲，平均（47.13±4.97）歲。3組患者的年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。分別取宮頸癌患者、CIN患者、子宮肌瘤患者相應(yīng)的宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 主要儀器與試劑生物組織烤片機(jī)購(gòu)自上海醫(yī)療儀器廠(chǎng)，BX50型光學(xué)顯微鏡、CK40型倒置顯微鏡均購(gòu)自日本Olympus公司，標(biāo)準(zhǔn)無(wú)酶移液槍頭購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；小鼠抗人FOXP3單克隆濃縮抗體及兔抗人CD3單克隆濃縮抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，小鼠抗人PD-L1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司，兔/鼠通用型Streptavidin-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）試劑盒[含二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液]及檸檬酸緩沖液均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)水平①將組織切片置入濕盒，以加樣器滴加適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液50 μl，室溫孵育30 min后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸洗3次，每次3 min，甩去多余液體；②將組織切片再次置入濕盒，以加樣器滴加適量封閉用正常羊血清工作液50 μl，室溫孵育30 min，甩去多余血清；③擦拭封閉用正常羊血清工作液，以加樣器分別在三份組織中滴加1滴（約50 μl）FOXP3+Treg 抗體工作液、PD-L1 抗體工作液、CD3抗體工作液（須覆蓋整個(gè)組織），置入4℃冰箱過(guò)夜，采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；④從4℃冰箱取出組織切片后室溫復(fù)溫1 h，以PBS浸洗3次，每次3 min，甩去多余液體，加樣器滴加適量生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗工作液，室溫孵育，PBS浸洗，甩干，將組織切片再次置入濕盒，加入適量HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育，PBS浸洗，甩干；⑤配置DAB顯色液，滴加適量DAB工作液，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并控制顯色時(shí)間，自來(lái)水沖洗10 min終止顯色，蘇木素復(fù)染3～5 min后，以1%鹽酸酒精分化，將染色后的玻片置入75%、85%、95%無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ中各浸泡5 min；⑥將玻片置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10 min使組織透明，在玻片組織上小心滴加中性樹(shù)膠1～2滴，加蓋玻片，自然晾干，于顯微鏡下仔細(xì)觀(guān)察染色結(jié)果，記錄并拍照。

1.2.3 陽(yáng)性判讀計(jì)數(shù)在細(xì)胞膜上和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有陽(yáng)性染色的細(xì)胞個(gè)數(shù)，分析FOXP3+Treg、PD-L1蛋白的表達(dá)情況。每張切片均選擇細(xì)胞數(shù)量較多的5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色或淡黑色為1分，棕黃色或棕黑色為2分，棕褐色或黑色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：0～24%為0分，25%～49%為1分，≥50%為2分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分的乘積為0～1分定義為陰性，2～6分定義為陽(yáng)性。

1.3 資料收集

收集患者資料，包括年齡、病灶大小、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染情況、FIGO分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分析FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；各變量間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，影響因素分析采用Cox回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況的比較

正常組織中較少表達(dá)或不表達(dá)FOXP3+Treg、PD-L1蛋白。FOXP3+Treg主要表達(dá)于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），在宮頸癌細(xì)胞中無(wú)表達(dá)；PD-L1主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞及TIL中，陽(yáng)性細(xì)胞孤立分布或聚集成小片狀，染色強(qiáng)。CD3為T(mén)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD3陽(yáng)性顆粒定位于TIL，TIL呈小圓形，核大質(zhì)少，呈點(diǎn)樣分布（圖1）。宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于CIN組織、正常宮頸組織，CIN組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況（SP染色，×400）

表1 不同組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系

FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.737、5.469、4.172，P＜0.05）；FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.854、5.263、5.567，P＜0.05）；而不同年齡、病灶大小及有無(wú)HPV感染的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況（n=75）

2.3 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)情況的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白表達(dá)情況與PD-L1蛋白表達(dá)情況呈正相關(guān)（r=0.602，P＜0.05）。

2.4 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的影響因素分析

將表2中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入Cox回歸分析模型，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的獨(dú)立影響因素。（表3）

表3 宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的影響因素分析

3 討論

近年來(lái)宮頸癌發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì)，因此研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展與腫瘤免疫逃逸機(jī)制有重要的臨床價(jià)值[4]。Treg為一類(lèi)免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞，其中FOXP3+Treg細(xì)胞具有廣泛的免疫抑制性，可通過(guò)表面膜分子與其他細(xì)胞直接接觸或以分泌抑制性細(xì)胞因子等方式抑制體內(nèi)多種免疫細(xì)胞活化及增殖[5-6]。PD-L1屬于CD28/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）受體亞家族，是免疫反應(yīng)中極其重要的協(xié)同刺激分子，在引起腫瘤微環(huán)境免疫耐受中發(fā)揮主導(dǎo)作用。有研究顯示，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1表達(dá)有升高趨勢(shì)[7]。但目前關(guān)于FOXP3+Treg、PD-L1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系研究較少。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3+Treg主要表達(dá)于TIL，PD-L1主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞及TIL，且宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于CIN組織、正常宮頸組織，CIN組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與高雁榮和郭玉[8]的研究結(jié)果相近，表明在宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白表達(dá)有升高趨勢(shì)。Treg可抑制其他T細(xì)胞活化，從而阻礙機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的監(jiān)視，并防止腫瘤相關(guān)抗原-抗體有效的免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸創(chuàng)造有利環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[9]，而其中FOXP3為T(mén)reg細(xì)胞最特異的標(biāo)志，參與Treg細(xì)胞的激活及功能調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)免疫動(dòng)態(tài)平衡不可缺少的因子，F(xiàn)OXP3在維持宿主免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗體的免疫無(wú)應(yīng)答性、抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)宿主造成的損害中有不可或缺的作用[10]。而PD-L1為協(xié)同刺激分子，可抑制T淋巴細(xì)胞功能，促進(jìn)Treg功能，PD-L1與程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱(chēng)PD-1）結(jié)合后使PD-1細(xì)胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸活化基序結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸磷酸化，募集酪氨酸蛋白磷酸酶-2，使下游酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3-激酶磷酸化，繼而抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，防止自身免疫應(yīng)答，而隨著宮頸病變級(jí)別升高，尤其是宮頸癌患者中細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)更強(qiáng)，因此FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更高。

本研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中的FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而不同年齡、病灶大小及有無(wú)HPV感染的宮頸癌患者宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與韓麗萍等[11]、孫曉慧[12]的研究結(jié)果基本一致。同時(shí)本研究進(jìn)一步進(jìn)行Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌組織中FOXP3+Treg、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的獨(dú)立影響因素，因此FOXP3+Treg、PD-L1參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，臨床分期越晚、惡性分化或存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的FOXP3+Treg、PD-L1表達(dá)上調(diào)更明顯[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中FOXP3+Treg蛋白表達(dá)情況與PD-L1蛋白表達(dá)情況呈正相關(guān)（r=0.602，P＜0.05），這與馬茜等[14]通過(guò)研究得出的FOXP3+Treg表達(dá)與異常分化細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)呈顯著正相關(guān)的結(jié)果相近。FOXP3為叉頭框蛋白家族成員，其在正常細(xì)胞中高度保守，整體蛋白由431個(gè)氨基酸構(gòu)成，而FOXP3是CD4+CD25+FOXP3+Treg發(fā)生、發(fā)展及發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子，也是目前天然Treg最可靠的表面標(biāo)志物[15]。FOXP3+在腫瘤局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，PD-L1則表達(dá)在活化的T細(xì)胞及B細(xì)胞上，F(xiàn)OXP3+Treg與PD-L1共同作用，使機(jī)體腫瘤環(huán)境處于免疫抑制強(qiáng)于免疫應(yīng)答狀態(tài)，促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生發(fā)展[16]。

綜上所述，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞FOXP3+Treg及相關(guān)免疫蛋白PD-L1在宮頸癌組織中高表達(dá)，可將其作為探索宮頸癌免疫治療的新靶點(diǎn)。