雷蕓，閆春良，薛旗山，趙秋紅

北京航天總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100076

在揭示非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）病情進(jìn)展機(jī)理的過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，增加惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的高表達(dá)能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的新生，促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而促進(jìn)毛細(xì)血管的新生，提高腫瘤組織的血流灌注水平[3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）不僅能夠參與VEGF信號(hào)通路的激活，還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控紊亂[4]。相關(guān)研究對(duì)VEGF在NSCLC患者中的表達(dá)情況進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中，VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率明顯上升[5]。但目前尚缺乏關(guān)于VEGF、VEGFR表達(dá)與NSCLC患者臨床特征關(guān)系的研究。本研究對(duì)VEGF、VEGFR在NSCLC患者NSCLC組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并對(duì)VEGF、VEGFR表達(dá)與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為NSCLC患者的診療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年12月北京航天總醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②經(jīng)胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查初步確診，經(jīng)纖維支氣管鏡病理學(xué)檢查或術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為NSCLC；③年齡≤79歲；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期使用免疫抑制劑；②既往具有放化療史；③伴有結(jié)締組織疾病、強(qiáng)直性脊柱炎、風(fēng)濕性疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入NSCLC患者90例，其中男49例，女41例；年齡45～79歲，平均（62.5±10.0）歲；TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期32例，Ⅲ期34例，Ⅳ期4例；腫瘤直徑≥5 cm 43例，腫瘤直徑＜5 cm 47例；病理學(xué)分級(jí)：G1級(jí)23例，G2級(jí)34例，G3級(jí)33例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。收集90例NSCLC患者的NSCLC組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤病灶邊緣3 cm以內(nèi)的肺組織）標(biāo)本。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

取NSCLC組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織，石蠟包埋，連續(xù)性切片，厚度3 μm，60℃烤片60 min，常規(guī)脫水后，采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）進(jìn)行抗原修復(fù)，加入10 μl蒸餾水，加入10%過氧化氫5 μl，室溫下孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，每次 3 min，加入 VEGF、VEGFR 單克隆抗體（1∶1000，購(gòu)自羅氏檢測(cè)公司），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的VEGF、VEGFR二抗（1∶2000，購(gòu)自羅氏公司），37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色后，PBS沖洗和復(fù)染，脫水后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果判定：VEGF、VEGFR蛋白的陽(yáng)性著色表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色或褐色表達(dá)。根據(jù)著色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，褐色、黑色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤10%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為11%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例為51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%。將著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，總分＜3分為蛋白陰性表達(dá)，≥3分為蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、VEGFR表達(dá)情況的比較

NSCLC組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)率為72.22%（65/90），明顯高于癌旁組織的13.33%（12/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=49.973，P＜0.01）；NSCLC組織中VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)率為68.89%（62/90），明顯高于癌旁組織的12.22%（11/90），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.455，P＜0.01）。（圖1）

圖1 NSCLC患者NSCLC 組織和癌旁組織中VEGF、VEGFR蛋白的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

2.2 NSCLC組織中VEGF、VEGFR表達(dá)與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、合并胸腔積液NSCLC患者NSCLC組織中VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)率均分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未合并胸腔積液的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2VEGF=4.712、8.140、5.777，PVEGF＜0.05；χ2VEGFR=7.204、4.438、8.025，PVEGFR＜0.05）；但不同腫瘤直徑、病理學(xué)分級(jí)NSCLC患者NSCLC組織中VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者NSCLC組織中VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)情況（n=90）

3 討論

NSCLC的發(fā)生與長(zhǎng)期生活習(xí)慣的改變有關(guān)[6]。腫瘤相關(guān)因子的改變能夠影響上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)、血流灌注及DNA的擴(kuò)增調(diào)控，促進(jìn)呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生[7-8]。本研究針對(duì)VEGF、VEGFR的表達(dá)情況進(jìn)行研究，希望能夠?yàn)榕R床上NSCLC的病因分析及免疫靶向治療提供參考。

VEGF是VEGF家族成員之一，其能夠通過激活細(xì)胞膜表面的蛋白激酶，影響肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活程度。相關(guān)研究表明，VEGF的表達(dá)不僅能夠促進(jìn)新血管生成，提高血管側(cè)支循環(huán)的建立能力，還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄[9]；VEGFR能夠通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)能力，激活下游磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞的基因錯(cuò)配修復(fù)能力[10]。已有研究表明，VEGFR表達(dá)水平的增高能夠增強(qiáng)肺泡上皮細(xì)胞的侵襲和遷移能力，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，進(jìn)而促進(jìn)患者的疾病進(jìn)展[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中VEGF、VEGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示VEGF、VEGFR表達(dá)水平增高與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。這主要由于VEGF、VEGFR表達(dá)水平增高能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力，增加腫瘤組織血流動(dòng)力學(xué)的紊亂風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)VEGF、VEGFR還能夠抑制細(xì)胞凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein，BAX）的表達(dá)，維持腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性增殖過程。姚月娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中，VEGF蛋白的表達(dá)水平可平均上升30%以上，在合并有明顯的局部轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處腫瘤擴(kuò)散的患者中，VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率上升更為顯著。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、合并胸腔積液NSCLC患者NSCLC組織中VEGF、VEGFR的陽(yáng)性表達(dá)率均分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未合并胸腔積液的患者（P＜0.05），提示VEGF、VEGFR表達(dá)水平增高與肺癌患者的病情進(jìn)展密切相關(guān)。而VEGF或VEGFR的表達(dá)對(duì)于胸腔積液形成的影響，考慮可能與二者的表達(dá)能夠提高血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)液體的滲出有關(guān)。

綜上所述，在NSCLC患者中，VEGF、VEGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，且VEGF、VEGFR表達(dá)與肺癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、合并胸腔積液情況密切相關(guān)。后續(xù)相關(guān)研究可以探討VEGF、VEGFR表達(dá)與肺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。