肖遠(yuǎn)俊，朱顓頊，蹇露，羅森源，田磊#

十堰市太和醫(yī)院1耳鼻咽喉頭頸外科，2婦產(chǎn)科，3病理科，湖北 十堰 442000

喉癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率較高，喉鱗狀細(xì)胞癌是喉癌最常見的病理類型，約占全部喉癌類型的90%[1-2]。目前研究認(rèn)為，遺傳、環(huán)境等多種因素均與喉鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)。某些類型的喉癌，如聲門下喉癌、跨聲門喉癌發(fā)病位置隱蔽，早期不易診斷，而聲門型喉癌雖然早期癥狀為發(fā)音易疲倦、無力等聲音改變，但并無其他臨床癥狀，多易被誤診為“咽喉炎”。多數(shù)患者確診喉癌時，已處于中晚期而不易治療[3]。WNT/β-聯(lián)蛋白（βcatenin）信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。β-catenin是WNT信號通路的調(diào)控因子之一，參與調(diào)控WNT/β-catenin信號通路。分泌型卷曲相關(guān)蛋白 1（secreted frizzled related protein 1，SFRP1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的WNT信號通路的阻斷劑，對WNT信號通路的信號傳導(dǎo)有重要影響[4]。目前，國內(nèi)關(guān)于SFRP1和β-catenin在喉鱗狀細(xì)胞癌中的研究較少。因此，本研究旨在探討喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測SFRP1和β-catenin蛋白的表達(dá)情況，探討其在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年1月十堰市太和醫(yī)院收治的喉鱗狀細(xì)胞癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者除原發(fā)性腫瘤外，無其他部位惡性腫瘤；術(shù)前未接受過放療、生物治療、化療等其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并高血壓、心血管、肝炎及結(jié)核等疾病的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者，其中男63例，女15例；＞55歲55例，≤55歲23例；腫瘤直徑：≤5 cm 46例，＞5 cm 32例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期45例，Ⅲ/Ⅳ期33例；分化程度：中高分化52例，低分化26例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有36例，無42例。78例患者均取得喉鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本，其中32例患者于距喉鱗狀細(xì)胞癌組織邊緣＞0.5 cm處取得癌旁組織標(biāo)本。

1.2 主要試劑

兔抗人SFRP1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體檢測試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

取78例患者的喉鱗狀細(xì)胞癌組織和其中32例患者的癌旁組織石蠟標(biāo)本以4 μm的厚度連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化。滴加3%的H2O2室溫下孵育10 min，使內(nèi)源性過氧化酶滅活。熱抗原修復(fù)后，室溫下自然冷卻，加入一抗（兔抗人SFRP1、鼠抗人β-catenin抗體，稀釋濃度為1∶100），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次2 min。然后采用DAB顯色劑進(jìn)行顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在光鏡下觀察SFRP1、β-catenin蛋白的染色情況，選取PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性表達(dá)的石蠟切片作為陽性對照[5-6]。

1.4 結(jié)果判定

3名及以上病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行觀察。光鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野（400倍），每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分：＜20%為0分，21%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：基本無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。SFRP1蛋白主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒判定為細(xì)胞陽性，將陽性細(xì)胞所占比例評分和染色強(qiáng)度評分相加，＞3分判定為SFRP1蛋白表達(dá)為陽性，≤3分判定為SFRP1蛋白表達(dá)為陰性。β-catenin蛋白主要定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜呈完整的棕黃色顆粒判定為細(xì)胞陽性，將陽性細(xì)胞所占比例評分和染色強(qiáng)度評分相加，＞3分且細(xì)胞膜著色完整判定為βcatenin蛋白正常表達(dá)，≤3分、細(xì)胞膜表達(dá)減弱或缺失（細(xì)胞膜的陽性細(xì)胞表達(dá)率≤70%）、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核異位表達(dá)（細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核出現(xiàn)顆粒狀染色細(xì)胞表達(dá)率＞10%）及細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)混合性染色均判定為β-catenin蛋白異常表達(dá)[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，喉鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)情況的影響因素采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)情況的比較

喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達(dá)率為26.92%（21/78），明顯低于癌旁組織的90.63%（29/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.138，P＜0.01）。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中β-catenin蛋白的異常表達(dá)率為85.90%（67/78），明顯高于癌旁組織的21.88%（7/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.244，P＜0.01）。

2.2 78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1和β-catenin 蛋白表達(dá)情況影響因素的單因素分析

不同年齡、性別和腫瘤直徑喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.839、5.379、9.003，P＜0.05）；不同TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中β-catenin蛋白異常表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.320、7.706、9.642，P＜0.05）。（表 1）

表1 不同臨床特征喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白的表達(dá)情況（n=78）

2.3 78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1和β-catenin 蛋白表達(dá)情況影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）作為自變量，SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)情況作為因變量，納入多元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化是喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)的獨(dú)立保護(hù)因素，是β-catenin蛋白異常表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是β-catenin蛋白異常表達(dá)的獨(dú)立保護(hù)因素。（表2、表3）

表2 78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)影響因素的多元Logistic回歸分析

表3 78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中β-catenin蛋白異常表達(dá)影響因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

WNT信號通路是一條對調(diào)控機(jī)體早期生長發(fā)育、器官形成及其他生理過程有重要作用，且在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。WNT/β-catenin信號通路是經(jīng)典的WNT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，當(dāng)無WNT信號刺激時，WNT/β-catenin信號通路處于“關(guān)閉”的狀態(tài)，β-catenin主要與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結(jié)合，維持細(xì)胞上皮的完整性；但當(dāng)WNT信號通路被異常刺激后，β-catenin通過核異位啟動轉(zhuǎn)錄過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖。β-catenin是細(xì)胞中的一種可溶性蛋白，是WNT信號通路的核心因子，β-catenin由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的過程，被認(rèn)為是WNT/β-catenin信號通路激活并發(fā)揮作用的重要標(biāo)志[9]。SFRP1是WNT/β-catenin信號通路的拮抗因子，可以通過競爭性抑制Frizzled（Fz）家族受體從而抑制WNT信號通路的活性。研究表明，SFRP1是喉鱗狀細(xì)胞癌中的抑癌基因，可通過啟動子的甲基化而失活[10]。目前，關(guān)于喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)情況的報(bào)道較少，具體作用機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步的研究。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測78例喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白的表達(dá)情況及其與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達(dá)率為26.92%，明顯低于癌旁組織的90.63%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、分化程度為低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白的陽性表達(dá)率，均低于TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，表明隨著喉鱗狀細(xì)胞癌病情的惡化，SFRP1表達(dá)下調(diào)或缺失，這可能是因?yàn)镾FRP1發(fā)生甲基化所致。多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化是喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP1蛋白陽性表達(dá)的獨(dú)立保護(hù)因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明SFRP1蛋白有可能成為喉鱗狀細(xì)胞癌生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

此外，本研究結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中β-catenin蛋白的異常表達(dá)率為85.90%，明顯高于癌旁組織的21.88%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期、分化程度為中高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗狀細(xì)胞癌患者喉鱗狀細(xì)胞癌組織中β-catenin異常表達(dá)率，均低于TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期、分化程度為低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，表明TNM分期越高，β-catenin異常表達(dá)率越高，下調(diào)β-catenin的表達(dá)可能會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，但仍需進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證，從而為喉鱗狀細(xì)胞癌患者尋找新的治療策略。

綜上所述，喉鱗狀細(xì)胞癌患者中SFRP1蛋白陽性表達(dá)率較低，但β-catenin蛋白的異常表達(dá)率較高，且隨著病情的惡化，SFRP1表達(dá)下調(diào)而β-catenin蛋白的異常表達(dá)上調(diào)，因此，SFRP1和β-catenin蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌患者病情診斷中具有重要的參考價值，可能成為臨床上對喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后預(yù)測 的重要指標(biāo)及生物靶向治療的新靶點(diǎn)。