劉黎，董華瓊，張匠，毛英，田婕麗，夏璐

遂寧市中心醫(yī)院腫瘤中心，四川 遂寧 629000

化療是目前乳腺癌患者最重要的治療方法之一，尤其是吉西他濱（gemcitabine，GCB）聯(lián)合紫杉醇或順鉑在晚期乳腺癌一線治療中占主導(dǎo)地位[1]，但腫瘤耐藥一直是腫瘤患者治療失敗及預(yù)后不良最關(guān)鍵且亟待解決的難題之一，因此，尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的分子靶點(diǎn)對(duì)臨床個(gè)體化治療十分重要。近幾年，微小RNA（microRNA，miRNA）是包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前大量的研究已經(jīng)證實(shí)多種miRNA不但具有細(xì)胞特異性，而且可以通過(guò)特定的方式參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥性[2-4]。Rhodes等[5]曾采用生物信息學(xué)技術(shù)證實(shí)miRNA-613在MCF-7化療耐藥細(xì)胞株中低表達(dá)，但并未對(duì)miRNA-613的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。因此，尋找miRNA-613關(guān)鍵下游靶基因以探討其對(duì)乳腺癌化療耐藥的作用機(jī)制是本研究的主要目的。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）作為誘導(dǎo)血管生成的主要調(diào)節(jié)因子，不僅與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及血管生成等有關(guān)[6]，而且有研究顯示其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性方面發(fā)揮重要的作用[7]。本研究通過(guò)建立GCB耐藥乳腺癌細(xì)胞株模型，探討miRNA-613對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231多藥耐藥的影響，并闡述其對(duì)下游靶基因VEGFA的調(diào)控機(jī)制，從而為逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥性的研究提供新的突破口，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將細(xì)胞株接種至含10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）、100 U/ml青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，2～3天傳代1次。

1.2 主要試劑

注射用GCB購(gòu)自美國(guó)禮來(lái)制藥公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）細(xì)胞消化液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；FBS和鏈霉素-青霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）、Trizol試劑、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；mirPremier?miRNA分離試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；報(bào)告基因載體pGL3空質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。miRNA-613模擬物（mimics）、陰性對(duì)照和PCR引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成和提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 人乳腺癌GCB耐藥細(xì)胞株的建立將MDA-MB-231細(xì)胞（1×107/ml）置于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；待融合率為40%～50%時(shí)，加入0.1 μmol/L的GCB；培養(yǎng)15～20天后，陸續(xù)采用終濃度為0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 μmol/L 的GCB進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3周加藥1次。最終獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/GCB，并在1.0 μmol/L GCB干預(yù)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，以維持其耐藥性。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)，將miRNA-613 mimics和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231/GCB細(xì)胞中，置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光染色情況，判斷感染率。提取細(xì)胞RNA，驗(yàn)證miRNA-613的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染成功后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選2～3周，對(duì)嘌呤霉素耐藥的細(xì)胞用于miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分組：未進(jìn)行任何處理的MDAMB-231/GCB細(xì)胞組（CTL組）、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（NC組）和miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染組）。

1.3.3 MTT 法檢測(cè)不同濃度GCB條件下MDAMB-231/GCB細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和MDAMB-231/GCB細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）分別單層接種至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)平行孔，分別加入0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L（終濃度）GCB 溶液。培養(yǎng)48 h后，加入MTT。孵育4 h后，置于450酶標(biāo)儀上，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（1-OD值受試組/OD值對(duì)照組）×100%。計(jì)算半數(shù)抑 制 濃 度（50%inhibition concentration，IC50）和MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。 RI=IC50（MDA-MB-231/GCB）/IC50（MDA-MB-231）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)法分析MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的遷移情況將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231/GCB細(xì)胞（1×105個(gè)/孔）單層接種至6孔板中，待細(xì)胞融合率為50%～60%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用1 ml藍(lán)色槍尖劃痕，記錄時(shí)間為W0h，加入含10%FBS和GCB（IC50=3.411 μmol/L）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h（W24h），置于倒置顯微鏡下觀察。采用愈合率對(duì)細(xì)胞的遷移活性進(jìn)行量化評(píng)估，愈合率=（W0h-W24h）/W0h×100%。相同條件下，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次，取平均值。

1.3.5 膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法分析MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的凋亡情況取CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入GCB（IC50=3.411 μmol/L）作用24 h后，收集細(xì)胞，洗滌3次后，以離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速3000 r/min 離心 5 min，棄除上清液；加入 500 μl結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸，加入AnnexinⅤ5 μl，避光孵育 15 min；加入 PI 5 μl，避光孵育15 min。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。采用流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）檢測(cè)3組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-613的相對(duì)表達(dá)量采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。采用凝膠電泳檢測(cè)RNA的相對(duì)分子質(zhì)量，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，采用mir-Premier?miRNA分離試劑盒分離miRNA，根據(jù)Super Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95℃ 10 min，95℃10 s，60℃30 s，循環(huán)45次。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)的資料設(shè)計(jì)PCR引物（表1）。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用說(shuō)明書(shū)調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。以β-actin為內(nèi)參，ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-（隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值），采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)通過(guò)Target Scan、microrna和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)篩選靶基因，發(fā)現(xiàn)miRNA-613有VEGFA基因的結(jié)合位點(diǎn)，VEGFA基因可能是miRNA-613下游的靶基因。通過(guò)構(gòu)建含靶基因野生型或突變型3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）的熒光酶報(bào)告基因質(zhì)粒，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性miRNA-613對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的抑制作用。方法如下：將VEGFA野生型或突變型3'-UTR序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3的XbaⅠ和FseⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，制備感受態(tài)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人上皮細(xì)胞HEK293T細(xì)胞約5×105個(gè)，接種于6孔板中，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)操作步驟轉(zhuǎn)染miRNA-613 mimics，采用Promega GloMaxTM20/20發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA-MB-231細(xì)胞和MDA-MB-231/GCB細(xì)胞增殖抑制率的比較

經(jīng)過(guò)6個(gè)月的誘導(dǎo)期，成功建立人乳腺癌細(xì)胞GCB耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/GCB，不同濃度（0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L）的 GCB 對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于MDAMB-231/GCB細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。GCB對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和MDAMB-231/GCB細(xì)胞的IC50分別為1.772 μmol/L 和8.791 μmol/L。MDA-MB-231/GCB的RI為4.96。

表2 不同濃度的GCB條件下MDA-MB-231和MDA-MB-231/GCB細(xì)胞增殖抑制率的比較

2.2 3組細(xì)胞miRNA-613相對(duì)表達(dá)量的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細(xì)胞miRNA-613相對(duì)表達(dá)量為（0.37±0.12），低于MDA-MB-231細(xì)胞的（0.74±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.448，P＜0.05）。miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞miRNA-613相對(duì)表達(dá)量為（1.47±0.18），高于 CTL組的（0.37±0.12）和NC組的（0.38±0.16），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.382、12.801，P＜0.05）（圖1）。

圖1 miRNA-613mimics 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miRNA-613的相對(duì)表達(dá)量

2.3 miRNA-613mimics轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞增殖抑制率的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，不同濃度（0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 μmol/L）的GCB 條件下轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的增殖抑制率高于CTL組細(xì)胞和NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。GCB對(duì)CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50分別為8.791、8.817、3.411 μmol/L。

表3 不同濃度的GCB條件下3組細(xì)胞miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后增殖抑制率的比較

2.4 3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞遷移活性的比較

3.411 μmol/L的GCB分別作用于CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞愈合率分別為（60.73±11.35）%、（62.41±14.57）%和（27.28±7.83）%。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移活性弱于CTL組和NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的遷移活性

2.5 3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞凋亡情況的比較

3.411 μmol/L的GCB分別作用于CTL組、NC組和轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞的凋亡率分別為（5.38±3.55）%、（5.97±3.26）%和（34.14±6.23）%。GCB對(duì)轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用強(qiáng)于CTL組和NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.345、11.332，P＜0.05）（圖3）。

2.6 3組MDA-MB-231/GCB 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的凋亡情況

3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-xLmRNA、BIMmRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組MDAMB-231/GCB細(xì)胞抗凋亡基因survivinmRNA、相關(guān)耐藥基因MDR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.769、55.627，P＜0.01），且轉(zhuǎn)染組細(xì)胞survivinmRNA、MDR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于CTL組細(xì)胞和NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

表4 3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表4 3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與CTL組比較，P<0.05；b與NC組比較，P<0.05

mRNACTL組NC組 轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA0.82±0.170.86±0.140.87±0.15 Bcl-xL mRNA0.74±0.130.71±0.150.73±0.11 BIM mRNA0.57±0.100.60±0.120.59±0.07 survivin mRNA1.14±0.281.10±0.230.54±0.20a b MDR1 mRNA2.26±0.452.18±0.370.56±0.24a b

2.7 MDA-MB-231/GCB細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞VEGFA mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細(xì)胞VEGFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.97±0.28），高于MDA-MB-231細(xì)胞的（1.02±0.24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.286，P＜0.05）。miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞VEGFAmRNA 相對(duì)表達(dá)量為（1.28±0.19），低于CTL組細(xì)胞的（1.97±0.28）和NC組細(xì)胞的（1.90±0.32），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.768、4.712，P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞VEGFAmRNA 的相對(duì)表達(dá)量

2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果

miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，野生型VEGFA 3'-UTR序列的報(bào)告基因質(zhì)粒熒光酶活性為（0.48±0.07），弱于 miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前的（1.00±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.900，P＜0.05）；miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前后突變型3'-UTR序列的報(bào)告基因質(zhì)粒熒光酶活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

以GCB化療為主的綜合治療方案已經(jīng)成為晚期乳腺癌的一線治療方案[8]，但是隨著化療次數(shù)的增加，部分腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生化療耐藥性，導(dǎo)致治療失敗。GCB屬于二氟核苷類(lèi)抗代謝物，在脫氧胞苷激酶的作用下，GCB被磷酸化，生成酸鹽活性代謝物，競(jìng)爭(zhēng)性插入DNA雙鏈中的結(jié)合位點(diǎn)，與鳥(niǎo)苷結(jié)合，從而抑制DNA的合成，促使腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。臨床上，至少50%的患者會(huì)對(duì)GCB產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。因此，尋找逆轉(zhuǎn)GCB耐藥的作用靶點(diǎn)，是進(jìn)行個(gè)體化治療及改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

本研究通過(guò)化療藥物梯度濃度遞增誘導(dǎo)法建立了人乳腺癌GCB耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/GCB，并采用MTT法證實(shí)其對(duì)GCB的耐藥性。已有的研究顯示，miRNA-613在乳腺癌組織中陰性表達(dá)或低表達(dá)。Wu等[10]也證實(shí)，miRNA-613可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲活性。因此，考慮miRNA-613與MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的耐藥性有關(guān)。miRNA作為非編碼小分子調(diào)控基因，可對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響下游蛋白的表達(dá)[11]。若這些靶基因與藥物的敏感性有關(guān)，則可能通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達(dá)影響藥物的抗腫瘤作用[12]。因此，本研究采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞miRNA-613的表達(dá)量，確定其轉(zhuǎn)染率達(dá)到70%以上后，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。加入GCB干預(yù)后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞增殖和遷移活性受到抑制，凋亡活性增加，表明miRNA-613在乳腺癌中屬于功能性基因，上調(diào)miRNA-613的表達(dá)量可增加MDA-MB-231/GCB耐藥細(xì)胞株對(duì)GCB的敏感性。真核細(xì)胞的凋亡途徑一般包括死亡受體途徑和線粒體途徑[13]。本研究結(jié)果顯示，3組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA、Bcl-xLmRNA、BIMmRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞survivinmRNA、MDR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于CTL組細(xì)胞和NC組細(xì)胞（P＜0.05），說(shuō)明miRNA-613誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡可能與survivin有關(guān)，而與內(nèi)源性線粒體途徑的關(guān)系并不明確。

腫瘤細(xì)胞對(duì)GCB耐藥的作用機(jī)制復(fù)雜，腫瘤血管生成被認(rèn)為是最重要的耐藥機(jī)制之一[14]。VEGFA作為目前活性最強(qiáng)、專(zhuān)屬性最高的腫瘤血管相關(guān)生長(zhǎng)因子之一，在化療耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[15]。通過(guò)Target Scan、microrna和miRanda等靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)，VEGFA基因序列存在與miRNA-613互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因分析，VEGFA可能是miRNA-613的下游靶基因。本研究顯示，miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染前，MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的VEGFAmRNA相對(duì)表達(dá)量高于MDA-MB-231細(xì)胞（P＜0.05），提示VEGFA可能與MDA-MB-231細(xì)胞的GCB耐藥有關(guān)；miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231/GCB細(xì)胞的VEGFAmRNA相對(duì)表達(dá)量低于CTL組細(xì)胞和NC組細(xì)胞（P＜0.05），進(jìn)一步從側(cè)面證實(shí)了上調(diào)miRNA-613的表達(dá)量對(duì)GCB耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用是通過(guò)抑制VEGFA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。另外，MDR1作為多藥耐藥基因，其編碼的P-糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成藥泵，將化療藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[16]；同時(shí)P-糖蛋白可以使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境堿化，降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[17]。與MDAMB-231細(xì)胞比較，MDA-MB-231/GCB細(xì)胞中MDR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高，而經(jīng)miRNA-613 mimics轉(zhuǎn)染后，MDR1mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，提示上調(diào)miRNA-613的表達(dá)量可能逆轉(zhuǎn)乳腺癌GCB耐藥細(xì)胞株對(duì)其他化療藥物的耐藥性。這一結(jié)論尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，上調(diào)miRNA-613的表達(dá)量可提高M(jìn)DA-MB-231/GCB細(xì)胞株對(duì)GCB的敏感性，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能與VEGFA相對(duì)表達(dá)量降低，腫瘤血管生成受到抑制有關(guān)。因此，miRNA-613可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌對(duì)GCB治療敏感性的參考指標(biāo)之一，同時(shí)miRNA-613可能成為逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥的新靶點(diǎn)，為臨床個(gè)體化治療提供新的思路。