許咪咪 盧仲明 張思毅 詹建東 盛曉麗 鄧敏鑫

1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院（廣州 510280）；2廣東省醫(yī)學科學院，廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（廣州510080）

目前，頭頸癌已經(jīng)是全世界第六大高發(fā)癌癥，根據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有645 000例新發(fā)生的頭頸癌病例[1]，其中超過90%頭頸癌為鱗狀細胞癌。喉癌作為第二位常見頭頸癌，大多是鱗狀細胞癌。頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響頭頸癌包括喉癌患者預后最重要的因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者生存率降低50%[2-3]。因此，術(shù)前頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評估尤為重要。

miRNA是一類細胞內(nèi)源性表達的、由22個單核苷酸組成的、單鏈小分子非編碼RNA，其主要功能為通過降解靶基因mRNA，從而進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達[4]。miRNA在某些疾病中的異常表達，因此miRNA可以作為部分疾病早期診斷的潛在標記物。同時，miRNA及其靶基因也可以作為特定疾病治療的療效評價預測指標及潛在藥物靶點。越來越多的研究表明，miRNA與喉癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-12]，但絕大多數(shù)研究都集中在miRNA的表達失調(diào)與喉癌發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)，至今未見與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA表達譜相關(guān)的報道。

本研究運用miRNA芯片技術(shù)，通過檢測分析喉鱗狀細胞癌（又稱喉鱗癌、喉癌）組織中miRNA的表達特點，尋找有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌腫瘤組織和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者差異表達的miRNA，探討其與喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為后續(xù)尋找與喉癌早期診斷及轉(zhuǎn)移相關(guān)的潛在的分子標志物打下初步基礎(chǔ)，為提高喉癌生存率及保喉率，最終改善喉癌的治療效果，提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源miRNA芯片入組患者：選擇5例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性喉鱗癌組織，為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌組織，為無轉(zhuǎn)移組，將兩組患者的腫瘤組織進行miRNA基因芯片分析并篩選。入組患者的臨床資料見表1。

qRT-PCR入組患者：選擇40例原發(fā)性喉鱗癌組織，20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，進行qRT-PCR驗證（表2）。

1.2 標本的收集、保存采用標本庫里凍存的喉鱗癌腫瘤組織，所有標本均來自廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2007年10月至2018年7月手術(shù)切除的喉癌組織，術(shù)中均取病理組織證實喉癌。本次實驗入組所有患者均為就診于廣東省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科并進行手術(shù)者，術(shù)前或者術(shù)中取病理確診喉鱗狀細胞癌，所有病例均為初治患者，術(shù)前未接受過放、化療及其他腫瘤的特殊治療。所有病例均進行詳細的臨床病理資料分析及隨訪。在參加本項實驗之前所有參與患者均簽署了書面知情同意術(shù)。本次實驗樣本的收集及使用通過了廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 喉癌組織miRNA表達譜分析本實驗采用第六代miRCURYTMLNA寡核苷酸芯片（丹麥Exiqon公司），超過1 891個探針。

1.4 總RNA提取及質(zhì)量檢測應用Trizol（Invitrogen公司）和miRNeasy mini kit試劑盒（Qiagen公司）抽提總RNA，使用分光光度計ND-1000（Nanodrop公司）測定RNA的質(zhì)量和定量，凝膠電泳判定RNA的完整性。

1.5 miRNA的標記與芯片雜交采用miRCURYTM Array Power標記試劑盒，按照試劑盒說明操作，進行miRNA的標記。熒光標記后的樣品，按說明書進行芯片雜交。

1.6 芯片掃描及數(shù)據(jù)處理采用Axon Gene Pix 4000B進行掃描，掃描得到的圖像用Gene Pix pro V6.0進行數(shù)據(jù)收集和坐標調(diào)整，數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用芯片顯著性分析軟件（significance analysis of microarrays，SAM）進行完成，設定錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）為 0.05；再采用 MEV software（v4.6，TIGR）對篩選出的miRNA進行聚類分析。根據(jù)表達水平定義高表達和低表達的miRNAs，篩選出在喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中表達差異的miRNAs。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證另取40對喉癌組織標本（20例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），提取總RNA。以U6為內(nèi)參照，采用SYBR Green染料法，對芯片分析結(jié)果中的5個miRNA：miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在各樣品中的表達量進行qRT-PCR驗證。

1.8 統(tǒng)計學方法MicroRNA基因芯片實驗結(jié)果采用SAM軟件進行分析，設定FDR為0.05，篩選出有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組之間差異表達的miRNA。用SPSS 19.0軟件分析，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 標本RNA純度及質(zhì)量檢測使用分光光度計ND-1000測定各標本RNA的OD值，OD260/OD280比值為1.9～2.1。凝膠電泳條帶分析未見明顯RNA降解及DNA污染等（圖1）。結(jié)果表明樣品總RNA未降解、質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)實驗。

圖1 用于芯片實驗的標本RNA凝膠電泳圖像Fig.1 Gel electrophoresis image of the samples RNA

2.2 miRNA芯片掃描結(jié)果筆者通過miRNA芯片篩查得到了2 662個差異表達的miRNA，將其中無法檢測到的miRNA及非人類miRNA剔除后，得到780個miRNA。采用SAM軟件分析，設定FDR為0.05，發(fā)現(xiàn)相對無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中共有387個miRNA表達顯著下調(diào)，22個miRNA表達顯著上調(diào)。見圖2、3。

圖2 喉鱗狀細胞癌miRNA微陣列芯片熱點圖Fig.2 Heatmap ofmiRNA microarray in laryngeal squamous cell carcinoma

圖3 通過SAM軟件分析獲得的顯著差異的miRNA基因Fig.3 Siginificant miRNA genes identified using SAM software

2.3 qRT-PCR驗證結(jié)果對miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203等 5個miRNA進行qRT-PCR驗證，miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在40例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組喉鱗狀細胞癌組織之間的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。將基因芯片分析結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果進一步進行比較，結(jié)果顯示這5個miRNA表達均下調(diào)，miRNA基因芯片分析結(jié)果與qRT-PCR的相符，見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)移組及無轉(zhuǎn)移組miRNA的qRT-PCRFig.4 qRT-PCR of the lymphatic metastasis group and the control group

3 討論

影響喉癌的預后因素很多，其中頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為一重要因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌預后較差，因此對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，學者們均持積極態(tài)度，主張行治療性頸清掃術(shù)[13]。以往雖然有大量關(guān)于喉癌遠處轉(zhuǎn)移的研究，但仍未發(fā)現(xiàn)任何一個指標能夠特異性的早期預測喉癌的轉(zhuǎn)移。所以，找出一種可以早期預測喉癌轉(zhuǎn)移的分子標志物，有助于個體化選擇治療方案。

miRNA是一類細胞內(nèi)源性表達的、由22個單核苷酸組成的、單鏈小分子非編碼RNA，其主要功能為通過降解靶基因mRNA，從而進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達[4]。有研究顯示，超過半數(shù)的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的脆性位點或基因組區(qū)[14]。miRNAs還可作用于細胞周期以及影響細胞的凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程[15-16]。自從1993年發(fā)現(xiàn)miRNA以來，其與腫瘤就存在著密切關(guān)聯(lián)，目前miRNA已在腫瘤的發(fā)生、診斷和治療等領(lǐng)域中取得一系列的研究進展。但是，就目前喉癌的相關(guān)研究而言，尚未發(fā)現(xiàn)兼具早期敏感性和組織特異性的miRNA。

本課題組前期通過miRNA芯片技術(shù)探測到了喉癌組織中的miRNAs表達情況，結(jié)果顯示：與癌旁組織相比，在喉癌組織中11種miRNAs表達顯著上調(diào)，表達顯著下調(diào)的miRNAs有114個，并且發(fā)現(xiàn)了 miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-203、let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-195-5p等6個miRNA在基因芯片分析及qRT-PCR中表達均顯著下調(diào)[8，17-18]。王蕊等[9]對4對喉癌腫瘤組織及癌旁組織行miRNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，22種miRNAs在喉癌組織中的表達顯著上調(diào)，20種表達顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-3195表達顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。魏明輝等[12]發(fā)現(xiàn)喉鱗癌腫瘤組織和癌旁組織中有53個差異表達的miRNAs，其中31個下調(diào)，22個上調(diào)。已有研究發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌[19-20]、食道癌[21]中miRNA異常表達，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。近年來越來越多對喉癌及癌旁組織miRNAs差異表達譜的分析，但是喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs差異表達譜尚未見相關(guān)報道。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，選取10例喉鱗狀細胞癌新鮮凍存的腫瘤組織（5例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），采用miRNAs表達譜芯片通過聚類分析，發(fā)現(xiàn)了22個在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達上調(diào)的miRNA和387個表達下調(diào)。本研究通過SAM軟件初篩，根據(jù)檢測樣本≥3，q-value≤5%，差異倍數(shù)＞2為顯著上調(diào)，差異倍數(shù)＜0.5為顯著下調(diào)，在差異表達的miRNAs中發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍以上的僅有5個，且表達均下調(diào)，分別miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203。其中miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-203在本團隊的前期的研究工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織及癌旁組織中差異表達并驗證。本研究對5個miRNAs進行qRT-PCR驗證，這樣可以延續(xù)筆者過往的研究，以期對將來的研究奠定基礎(chǔ)。

通過qRT-PCR驗證，miR-125a-5p、miR-144-3p、miR-193a-3p、miR-24-3p、miR-203在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達均顯著下調(diào)，這與基因芯片分析結(jié)果一致，說明本研究的基因芯片分析結(jié)果是準確可靠的。證明了有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比存在差異表達的miRNAs，結(jié)果提示這些差異表達的miRNAs可能在喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

miR-144-3p已在本團隊的前期研究工作中被證實可以通過靶向ETS-1調(diào)控喉癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[22]，并初步發(fā)現(xiàn)其可以抑制喉癌細胞的增殖[23]。這提示有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中差異表達的miRNAs可能與喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。這為筆者后續(xù)研究miR-125a對喉癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用提供初步的依據(jù)。

然而，基因芯片分析及qRT-PCR驗證的miRNAs是否真正參與喉癌的發(fā)省發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移，需要將來在細胞功能實驗及大規(guī)模的臨床標本中進行進一步驗證。