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        EphA2和Twist蛋白在宮頸病變中的表達及與宮頸癌患者預后的關系

        2019-08-24 06:25:12葉俊良陳曉宇趙衛(wèi)東陳先俠
        實用醫(yī)學雜志 2019年15期
        關鍵詞:上皮宮頸癌宮頸

        葉俊良 陳曉宇 趙衛(wèi)東 陳先俠

        1安徽省婦幼保健院(合肥 230001);2中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院婦科(合肥 230001);3安徽醫(yī)科大學組胚教研室(合肥 230032)

        在婦科惡性腫瘤中宮頸癌發(fā)病占第2位。宮頸癌早期即有侵襲性和遠處轉移特點,其發(fā)病機制目前尚未完全清楚,因此探討其發(fā)病機制,將為其預防和治療提供理論依據(jù)[1]。在惡性腫瘤的浸潤生長中,快速增長的惡性腫瘤可通過血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)而供氧,上皮細胞激酶(epithelial cell kinase,EphA2)是重要的VM相關信號轉導蛋白,其在黑色素瘤、乳腺癌[2]細胞生長中呈高表達,抑制EphA2蛋白表達,可抑制腫瘤的生長。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮細胞向間充質轉化,在腫瘤發(fā)生和浸潤生長中作用顯著[3]。轉錄因子Twist與細胞遷移調控相關;同時,Twist具有癌基因特點,高表達于惡性腫瘤中,通過調控EMT干預腫瘤的侵襲性[4]。在宮頸癌發(fā)病機制研究中,檢測VM相關蛋白EphA2和轉錄因子Twist蛋白,及其表達與宮頸癌關系尚未見文獻報道。本研究檢測近年我院宮頸癌和上皮瘤變患者術后病變組織中EphA2、Twist蛋白表達情況,分析兩者對宮頸癌可能的預后價值。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料收集96例2013年11月至2018年10月安徽醫(yī)科大學婦幼保健醫(yī)院因宮頸癌入院患者,患者均經術后病理學證實,按照2009年國際婦產科聯(lián)盟(FIGO)宮頸癌臨床分期標準,96例宮頸癌中Ⅰa期27例,Ⅰb期36例,Ⅱa期33例,病理類型:宮頸鱗狀細胞癌62例,腺癌25例,腺鱗癌9例。同時收集26例宮頸上皮瘤變的宮頸組織錐切術后標本。122例患者年齡29~71歲,平均(38.6±12.7)歲?;颊呔鶡o其他較為嚴重的合并癥,術前均未接受放療或化療處理。取部分組織置10%福爾馬林溶液中固定,另取標本液氮中凍存,擬行蛋白免疫印跡用。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,患者對研究均知情,并簽署知情同意書。

        1.2 主要試劑Ⅰ抗:兔抗人Twist、EphA2多克隆抗體(美國Santa Cruz生物技術公司);內參照兔抗人β-actin多克隆抗體(美國Abcam公司);抗原修復液、通用型二抗、DAB顯色劑、蘇木精、PBS緩沖液、中性樹脂(北京中杉金橋有限公司),蛋白裂解液(美國Sigma公司),BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光顯色液(美國Bio-rad公司);其他試劑均為國產分析純。

        1.3 免疫組化染色及結果判斷免疫組化SP法檢測宮頸腫瘤組織中EphA2、Twist蛋白表達,簡要步驟如下。10%福爾馬林溶液固定手術標本,石蠟包埋,3 μm厚切片,二甲苯脫蠟,100%、95%、80%乙醇浸泡至水,微波枸櫞酸鈉溶液抗原修復,室溫羊血清封閉抗原20 min,滴加兔抗人多克隆一抗(Twist,1∶300稀釋;EphA2,1∶200稀釋),4 ℃孵育過夜;次日,PBS清洗,滴加羊抗兔二抗50 μL室溫孵育1 h,DAB顯色,顯微鏡下檢查染色情況,流水沖洗中止反應,蘇木素復染,中性樹膠封片,鏡檢。判定EphA2、Twist免疫組化染色結果由3名病理科醫(yī)生獨立完成,參照文獻[5]的方法,按照細胞質(或核)染色呈黃色或棕黃色判定為陽性細胞;(1)記錄陽性染色細胞占總細胞的百分比(×40倍物鏡下),每張切片隨機記錄5個視野,0分,0% ~10%;1分,10% ~25%;2分,26% ~50%;3分,50%~75%;4分,>75%。(2)記錄陽性細胞染色程度,0分,陰性,無著色;1分,弱陽性“+”,呈淺黃色;2分,陽性“++”,呈黃色;3分,強陽性“+++”,呈棕褐色。判斷EphA2、Twist蛋白免疫組化結果濃度分布評分,采取兩項乘積,0分,陰性;低表達,1~4分;高表達,>4分。

        1.4 WesternBlot檢測宮頸病變組織中EphA2、Twist蛋白表達 隨機取手術切除宮頸病變組織,每組5例,液氮凍存。行Western Blot檢查時,先加入RIPA裂解液裂解宮頸腫瘤組織研磨呈粉狀,超聲破碎,應用BCA法測定樣品蛋白濃度,定量后總蛋白上樣量30 μg,SDS-PAGE電泳,濃縮膠(電壓60 V)-分離膠(電壓100 V)電泳1.5 h,PVDF膜轉膜,5%脫脂牛奶封閉。加入Ⅰ抗兔抗人多克隆抗體(Twist,1∶2 500稀釋;EphA2,1∶2 000稀釋;β-actin,1∶2 000稀釋),4℃孵育過夜,次日,洗膜后分別加入辣根酶標記的羊抗兔二抗孵育1 h,ECL化學發(fā)光顯影,曝光,采用Image J軟件計算條帶灰度,以β-actin為內參,目標蛋白相對表達水平采用EphA2、Twist蛋白和β-actin比值表示。

        1.5 隨訪采取門診復查和電話等方式隨訪,以手術日開始患者生存期,截止期為2018年10月,6例患者失訪,隨訪3~60個月,中位隨訪時間為36個月,死亡9例,其中Ⅰa期1例,Ⅰb期4例,Ⅱa期患者4例。

        1.6 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0軟件包,EphA2、Twist蛋白表達水平與臨床病理間聯(lián)系采用獨立樣本t檢驗,蛋白相對表達量采用表示,Kaplan-Meier法分析宮頸腫瘤陽性蛋白表達與患者生存率聯(lián)系,Log-rank檢驗患者生存率曲線,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 EphA2、Twist蛋白在宮頸病變組織中的表達EphA2蛋白在宮頸腫瘤組織中主要表達于細胞質、細胞核,呈黃色或棕黃色,在宮頸上皮瘤變組織、Ⅰa期宮頸癌、Ⅰb期宮頸癌、Ⅱa期宮頸癌中陰性、低表達率與高表達率分別為38.5%(10/26)、42.3%(11/26)、19.2%(5/26);24.2%(8/33)、45.5%(15/33)、33.3%(10/33);16.7%(6/36)、52.8%(19/36)、30.6%(11/36);7.4%(2/27)、48.1%(13/27)、44.4%(12/27)。結果表明,隨著宮頸腫瘤組織病理分期升高,EphA2的表達逐漸升高,在Figo臨床分期中,Ⅰb期、Ⅱa期宮頸癌與上皮瘤變比較差異有顯著性(P<0.05,表1、圖1)。Twist蛋白在宮頸腫瘤組織中主要表達于細胞質、細胞核,呈黃色或棕黃色,在宮頸上皮瘤變組織、Ⅰa期宮頸癌、Ⅰb期宮頸癌、Ⅱa期宮頸癌中陰性、低表達率與高表達率分別為42.3%(11/26)、46.2%(12/26)、11.5%(3/26);33.3%(9/33)、48.5%(16/33)、24.2%(8/33)%;22.2%(8/36)、52.8%(19/36)、25.0%(9/36);11.1%(3/27)、51.9%(14/27)、37.0%(10/27)。結果表明,隨著宮頸癌組織病理分期升高,Twist蛋白表達逐漸升高,與上皮瘤變組織中Twist蛋白表達比較差異有顯著性(P<0.05,表1、圖2)。

        圖1 宮頸腫瘤組織中EphA2蛋白陽性表達(SP×400)Fig.1 The positive expression of protein EphA2 in cervical tumor tissues(SP × 400)

        圖2 宮頸腫瘤組織中Twist蛋白陽性表達(SP×400)Fig.2 The positive expression of Twist protein in cervical tumor tissues(SP × 400)

        表1 EphA2與Twist蛋白在宮頸腫瘤組織中的表達Tab.1 The expression of EphA2 and Twist proteins in cervical tumor tissues 例

        2.2 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征相關性本研究探討96例宮頸癌組織中EphA2、Twist表達與患者臨床病理特征間的相關性,結果表明,腫瘤深肌層浸潤程度、淋巴結轉移有相關性(P<0.05,P<0.01);兩種蛋白表達與年齡、腫瘤類型、Figo臨床分期、腫瘤大小無相關性,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2)。

        2.3 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸病變患者預后的相關性分析對26例子宮頸上皮瘤變、96例宮頸癌患者隨訪情況,其中5例失訪,14例死亡,中位隨訪時間36個月,EphA2蛋白表達為陰性患者病死率為0%(0/26),低表達患者病死率為6.89%(4/58),高表達患者病死率為 26.32%(10/38)。Twist蛋白表達為陰性患者病死率為0%(0/31),低表達患者病死率為9.84%(6/61),高表達患者病死率為26.67%(8/30)。Log rank檢驗表明,EphA2和Twist蛋白表達水平不同,生存率差異有顯著性(χ2=12.663、19.916,P<0.01)。見圖3。

        2.4 WesternBlot檢測 EphA2和Twist蛋白在不同分期宮頸病變中的表達Western Blot結果表明,宮頸上皮瘤變組織中EphA2和Twist蛋白表達較弱,Ⅰa級宮頸癌組織蛋白的表達增強,且隨著病理分期升高,EphA2和Twist蛋白的表達增強(圖4A)。由圖像分析可知,與宮頸上皮瘤變組織比較,宮頸癌組織中EphA2/β-actin和Twist/β-actin相對蛋白表達量明顯升高(圖4B)。

        3 討論

        宮頸癌的發(fā)病機制目前未明,探明其發(fā)生機制可為治療提供新的理論依據(jù)。目前,經典的血管內皮生成的理論認為,為獲取充足營養(yǎng),直徑>2 mm實體腫瘤需要新生血管,在血管生成因子誘導下,惡性腫瘤細胞破壞血管內皮基底膜,形成有孔內皮和片狀基膜,同時,抗血管生成可有效治療腫瘤[6]。1999年,MANIOTIS等研究眼黑色素瘤微循環(huán)時,提出不依賴內皮的新型腫瘤微循環(huán)模式,即VM。在腫瘤細胞EMT過程中,起源于中胚層的血管間葉組織代替起源于內胚層的上皮組成,在腫瘤細胞周圍形成管樣結構,模擬血管功能,血細胞可以在此類管道樣結構中流動,供給腫瘤組織營養(yǎng)。隨后,在肝癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)存在VM[3-4,7],且與腫瘤的生長、分化、侵襲性等相關。VM相關的信號通路關鍵蛋白EphA2為受體蛋白酪氨酸激酶,可調節(jié)血管生成,已有研究[8]證實,在惡性黑色素瘤干預中,通過抑制EphA2的表達,顯著抑制黑色素瘤的增殖。本研究通過免疫組織化學和Western Blot均證實,在臨床高分期的宮頸癌中,EphA2表達較上皮瘤變和低分期宮頸癌明顯,且EphA2高表達與宮頸癌的復發(fā)呈正相關。這為可能利用干預EphA2表達治療宮頸癌提供理論依據(jù)。

        表2 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征比較Tab.2 Comparison of EphA2 and Twist protein expression with clinicopathological features of cervical cancer例

        圖3 宮頸病變中兩種蛋白表達與Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 The expression of EphA2 and Twist proteins in cervical tumor tissues and the Kaplan-Meier survival curve

        圖4 蛋白免疫印跡檢測EphA2和Twist蛋白在不同分期宮頸癌組織中的表達Fig.4 The expression of EphA2 and Twist protein in different stages

        宮頸癌的發(fā)病中,存在癌基因激活、信號轉導失調、細胞凋亡抑制等機制[9]。轉錄調節(jié)因子Twist參與胚胎發(fā)育和新血管生成,調控EMT,常染色體編碼的Twist基因位于堿性螺旋-環(huán)-螺旋,能夠調節(jié)組織重建,細胞遷移,過量表達的Twist基因能夠促進細胞惡性表型的轉化,在特定的情況下,可以促進上皮細胞向間充質細胞轉化、增強細胞運動和遷移能力,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉移中作用明顯[10]。本研究結果表明,與宮頸上皮瘤變相比,宮頸癌中Twist蛋白表達明顯上升,且高級別臨床分期的宮頸癌中,Twist蛋白表達更為明顯,故Twist蛋白參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。在宮頸腫瘤預后中,Twist蛋白表達為陰性患者無病死,而高表達Twist蛋白的宮頸癌患者病死率顯著升高,說明Twist蛋白的表達在宮頸癌患者預后中可能有一定的應用價值。

        本研究同時比較了EphA2和Twist蛋白與96例宮頸癌臨床病理參數(shù)間的聯(lián)系,結果表明,EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌患者組織學分化級別、腫瘤深肌層浸潤程度、淋巴結轉移有相關性,而與與年齡、腫瘤類型、Figo臨床分期、腫瘤大小無相關性??梢奅phA2和Twist蛋白在宮頸癌的進展、轉移中起重要作用。同時,值得注意的是,雖然宮頸癌組織中EphA2和Twist蛋白與宮頸上皮瘤變中有差異性,但在Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa級宮頸癌組織中表達無差異性,有待進一步擴大病例數(shù),減小分析過程中可能出現(xiàn)的偏倚情況;同時,近期隨訪時間不足有待進一步完善。下一步筆者將在擴大樣本的基礎上,進一步分析聯(lián)合檢測EphA2和Twist蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

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