李明國 劉叢 吳謙 李興華 楊福兵 游國亮

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（四川瀘州646000）；2內(nèi)江市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（四川內(nèi)江 646000）

癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)。近年來隨著腫瘤免疫逃逸機(jī)制相關(guān)研究的不斷深入，腫瘤微環(huán)境在腫瘤免疫逃逸過程中的作用受到越來越多的關(guān)注[1-2]。而腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）是上述微環(huán)境中最主要的宿主細(xì)胞。CAFs是一類不同細(xì)胞源性的細(xì)胞群，可來源于多種細(xì)胞，如靜止的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞[3-6]。近年來的研究顯示，程序性死亡蛋白-1的配體（programmed death-ligand 1，PD-L1）是重要的免疫抑制性分子，不僅在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在腫瘤組織中的成纖維細(xì)胞中也出現(xiàn)過表達(dá)?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)PD-L1可通過與T細(xì)胞表面的的PD-1結(jié)合，介導(dǎo)免疫異質(zhì)性信號從而參與腫瘤免疫逃逸。該異質(zhì)性信號不僅抑制T細(xì)胞增殖和活化，還能導(dǎo)致其處于失活狀態(tài)[7-8]。本研究的主要目的是探討腫瘤細(xì)胞對成纖維細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自美國Hycolne公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自德國PAN公。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）和雙抗（青霉素+鏈霉素）購自武漢塞維爾生物科技有限公司?；|(zhì)膠購自美國BD公司。胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司。PD-L1、CD63和α-SMA對應(yīng)的一抗購自美國Sigma公司。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材購自江蘇無錫耐思生物科技有限公司。Tanswell小室購自美國Corning公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Forma；超凈工作臺購自北京中化生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞H4細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CTCC）。人腦成纖維細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司（CP-H125），本研究通過倫理委員會的批準(zhǔn)并保證整個研究過程符合倫理學(xué)要求。H4細(xì)胞和人腦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%（體積比）FBS的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、約95%濕度、5%CO2濃度。細(xì)胞隔天換液，每3天傳代1次。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法收獲組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組樣品均取15 μg蛋白，加入5×loading buffer體，吹打混勻后置于95℃干浴鍋中變性5 min。配制聚丙烯酰分離膠和濃縮膠，將樣品和蛋白marker加入各孔道，80 V恒壓條件下電泳10 min后，將電壓調(diào)120 V電壓，電泳1.2 h；然后在取出凝膠，在200 mA條件下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。取出PVDF膜，置于牛奶中封閉2 h后，分別以PDL1（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）、CD63（1∶1 000）一抗抗體孵育過夜（4℃）。TBST洗膜3次（每次10 min），然后加入與一抗來源對應(yīng)的二抗孵育2 h（室溫），TBST洗膜3次（每次10 min）。最后加入化學(xué)發(fā)光劑顯色，利用蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析結(jié)果。

1.4 外泌體分離收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，按下列方法一次離心：（1）2 500 r/min離心20 min，收集上清；（2）11 000 r/min離心20 min，再次收集上清；（3）0.2 μm濾器過濾，收集過濾液；（4）34 000 r/min離心70 min，棄上清，PBS重懸沉淀；（5）34 000 r/min離心70 min，棄上清，以150 μL PBS重懸所得沉淀，并用BCA法測定重懸液體的蛋白濃度。將樣品分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

1.5 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將Transwell小室置于6孔板上，將腫瘤細(xì)胞接種于上室，成纖維性細(xì)胞接種于孔板中（對照組），或直接將腫瘤細(xì)胞外泌體或去除外泌體后的條件培養(yǎng)基加入上室（實(shí)驗(yàn)組），建立共培養(yǎng)體系。培養(yǎng)一定時間后，從培養(yǎng)箱中取出Transwell小室。胰酶消化成纖維細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞免疫熒光將細(xì)胞固定、血清封閉，滴加適量α-SMA一抗（1∶200），37℃孵育1 h；然后用PBS漂洗以洗去多余抗體；滴加適量對應(yīng)二抗，37℃避光孵育30 min，用PBS漂洗3次（每次5 min）以去除多余二抗。最后用含DAPI封片劑封片；利用置于熒光顯微鏡拍照和分析結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)胰酶消化成纖維細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，向成纖維細(xì)胞重懸液中加入PD-L1單克隆抗體（1∶100），室溫孵育30 min；離心去除多余抗體后以PBS重懸細(xì)胞；加入熒光標(biāo)記二抗（1∶200），37℃孵育30 min，PBS洗滌3次（每次5 min）；最后加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。利用GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及制圖。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。利用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。兩組之間統(tǒng)計分析采用t檢驗(yàn)，兩組以上統(tǒng)計分析采用單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤相關(guān)腦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定將腦原代成纖維細(xì)胞與H4細(xì)胞分別接種于Transwell的下室和上室共同培養(yǎng)。Western blot結(jié)果（圖1A）顯示，隨著兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)時間的延長，成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而波形蛋白（vimentin）表達(dá)水平基本維持不變。免疫熒光結(jié)果（圖1B）進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可上調(diào)成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)腦原代成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化。

圖1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)原代腦成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化Fig.1 Transforming of primary brain fibroblasts into cancer-associated fibroblasts induced by glioblastoma cells

2.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)腦成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1流式細(xì)胞術(shù)檢測成纖維細(xì)胞-膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞共培養(yǎng)2、4和6 d，成纖維細(xì)胞PD-L1陽性細(xì)胞比例逐漸增高，分別為（10.40±1.31）%（P=0.0004）、（48.67 ± 2.19）%（P=0.0001）和（98.17 ± 0.78）%（P=0.0001），明顯高于對照組（0.70±0.37）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A、B）。上述結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)腦成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1。

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)腦原代成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1 Fig.2 PD-L1 expression of primary brain fibroblasts was enhanced by glioblastoma cells

2.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過外泌體誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1收集H4細(xì)胞外泌體，Western Blot檢測結(jié)果顯示外泌體中高表達(dá)PD-L1和外泌體標(biāo)志分子CD63（圖3A）。將外泌體加入到成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)6 d。流式細(xì)胞術(shù)檢測成纖維性細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平，結(jié)果顯示，H4細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1，且誘導(dǎo)能力與外泌體濃度有關(guān)（圖3B）。10、20和40 μg/mL組成纖維細(xì)胞PD-L1陽性率分別為（18.40±11.45）%、（38.67±2.19）%和（68.17±7.7）%，明顯高于對照組（2.37±0.98）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果證明，H4細(xì)胞外泌體可能參與H4誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1。

為了進(jìn)一步明確外泌體在誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1中的作用，收集H4完全培養(yǎng)基，超速離心法去除其中外泌體。用去除外泌體的H4細(xì)胞培養(yǎng)基與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與腫瘤細(xì)胞完全培養(yǎng)基相比，共培養(yǎng)2、4和6 d，成纖維細(xì)胞PD-L1陽性率分別為（12.53±1.22）%、（13.93 ± 1.59）%和（13.87 ± 3.02）%，去外泌體條件培養(yǎng)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞PD-L1表達(dá)的能力降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.45，Controlvs.day2，P=0.0036；Controlvs.day4，P=0.0015；Controlvs.day6，P=0.0016；圖4）。以上結(jié)果證明，外泌體可能在H4細(xì)胞誘導(dǎo)誘導(dǎo)腦原代成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1的過程中起重要作用。

圖3 H4細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1Fig.3 PD-L1 expression of fibroblasts was enhanced by H4 cell-derived exosomes

圖4 H4細(xì)胞去外泌體培養(yǎng)基誘導(dǎo)成纖維性細(xì)胞表達(dá)PD-L1Fig.4 PD-L1 expression of fibroblasts induced by H4 exosome-free conditioned medium

3 討論

PD-1全名為程序性死亡受體-1，主要表達(dá)于激活的T細(xì)胞表面[9]。PD-L1是PD-1的配體，在正常情況下其功能是與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞激活，以避免因T細(xì)胞過度激活而引起自身免疫病[10-11]。然而，腫瘤細(xì)胞在其進(jìn)化過程中選擇性高表達(dá)PD-L1，并與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，產(chǎn)生免疫抑制性信號，使T細(xì)胞喪失對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸[12-15]。最新研究[16-17]顯示，在腫瘤組織中，不僅腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，成纖維細(xì)胞也高表達(dá)PD-L1。成纖維細(xì)胞中PD-L1表達(dá)具有何種生物學(xué)作用，其表達(dá)受何種信號調(diào)控，至今仍然不清楚。本研究首先驗(yàn)證了膠質(zhì)瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)腦原代成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)水平上調(diào)。隨后筆者用細(xì)胞間接共培養(yǎng)的方法證明膠質(zhì)瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1，且這種誘導(dǎo)作用不需要膠質(zhì)瘤和成纖維細(xì)胞直接接觸。本研究的結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞不僅可誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化，同時可上調(diào)正常成纖維細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平。

外泌體是由細(xì)胞分泌產(chǎn)生的直徑在50～120 nm的一類細(xì)胞外囊泡，攜帶豐富的生物活性分子（如蛋白質(zhì)、RNA等），并可這些生物信息分子傳遞給臨近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞，調(diào)控受體細(xì)胞的功能和生物學(xué)行為[18-21]。腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中主要組成細(xì)胞，因此筆者猜測，成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1可能與腫瘤細(xì)胞分泌外泌體有關(guān)。本研究的結(jié)果證實(shí)，去除外泌體的H4細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1的能力明顯低于含外泌體的H4細(xì)胞培養(yǎng)基，表明外泌體在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1過程中起關(guān)鍵作用。

綜上，本研究提示腫瘤外泌體在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，影響微環(huán)境中細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，仍需要進(jìn)一步研究來明確，是否有細(xì)胞因子參與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)PD-L1。