孟仁亮，謝陽(yáng)，張瑤，李作孝

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）脫髓鞘疾病，其病理特點(diǎn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性多發(fā)性炎性脫髓鞘、軸突損害［1］。MS 是青年人，尤其是女性中除創(chuàng)傷外嚴(yán)重致殘的第一大原因［2］。目前的治療方法以緩解MS 的臨床癥狀、控制疾病的發(fā)展為主，但尚無(wú)根治措施。而髓鞘有保護(hù)神經(jīng)元、快速傳遞神經(jīng)沖動(dòng)以及對(duì)神經(jīng)軸突的絕緣和支持作用。髓鞘在CNS中的形成細(xì)胞是少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs），后者由少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）分化而來(lái)［3］。OPCs 廣泛存在于CNS，脫髓鞘后，在信號(hào)刺激下激活并增殖、遷移、分化為成熟的OLs，重新包繞軸突，形成再髓鞘。有文獻(xiàn)報(bào)道，毒蕈堿通路在眾多調(diào)節(jié)OPCs 增殖、分化的信號(hào)通路中具有重要作用［4］。通過使用微柱陣列的高通量功能篩選系統(tǒng)，Mei等［5］篩選了一組能夠促進(jìn)OLs 的分化和髓鞘化的毒蕈堿拮抗劑，其中的富馬酸氯馬斯汀能夠高效通過血-腦屏障。在基礎(chǔ)研究中，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）與MS 有相似的免疫和病理表現(xiàn)，是其理想的動(dòng)物模型。故本實(shí)驗(yàn)選取富馬酸氯馬斯汀連續(xù)干預(yù)EAE 小鼠，評(píng)估其是否對(duì)EAE 小鼠脫髓鞘后的再髓鞘化有促進(jìn)作用，以期為MS的臨床治療帶來(lái)更多的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50 只SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)用C57BL/6 雌性小鼠，6～8周，16～20 g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（渝）2018-0003。實(shí)驗(yàn)前于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品 富馬酸氯馬斯汀購(gòu)自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司；EAE模型誘導(dǎo)抗原髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55（MOG35-55）購(gòu)自吉爾生化（上海）有限公司；結(jié)核桿菌購(gòu)自上海瑞楚生物科技有限公司；百日咳素（PTX）和完全弗氏佐劑（CFA）均購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、Luxol Fast Blue（LFB）染液試劑盒和HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；兔抗GAPDH 抗體、兔抗小鼠髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體購(gòu)自Abcam公司（英國(guó)）；TRIpure總RNA提取劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均購(gòu)自科鹿（武漢）生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物分組、制模和實(shí)驗(yàn)干預(yù) 將50 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，即正常對(duì)照組、EAE模型組和氯馬斯汀高、中、低劑量組，每組10只。根據(jù)文獻(xiàn)［6］，EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組進(jìn)行EAE模型制備，將抗原MOG35-55用PBS液稀釋成3 g/L，用等體積CFA（含5 g/L 的結(jié)核菌素）混勻至乳濁液，在小鼠脊柱段兩側(cè)任選2 點(diǎn)，以0.2 mL/只的劑量進(jìn)行皮下注射。正常對(duì)照組每只注射等量的生理鹽水及CFA。建模后當(dāng)天及第2 天，將PTX 以0.2 mL/只注入各組小鼠腹腔，加強(qiáng)免疫反應(yīng)。每日取避光保存富馬酸氯馬斯汀30 mg，溶解于注射用水中，稀釋，配成溶液濃度為2 g/L。氯馬斯汀高、中、低劑量組從第1～21 天分別以40、20、10 mg/（kg·d）腹腔注射富馬酸氯馬斯汀預(yù)防性給藥，正常對(duì)照組和EAE模型組以10 mg/（kg·d）腹腔注射生理鹽水。

1.4 EAE小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 自建模后每天（直至處死小鼠）定時(shí)評(píng)判小鼠臨床表現(xiàn)，進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，無(wú)臨床癥狀；1 分，尾部拖地，輕度后肢無(wú)力；2分，中度后肢無(wú)力；3 分，重度雙后肢無(wú)力；4 分，四肢全癱；5分，抽搐、瀕死或死亡。如小鼠的癥狀處于兩評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)之間，據(jù)實(shí)際±0.5計(jì)分。

1.5 實(shí)驗(yàn)終止 以建模當(dāng)日為第1天，連續(xù)飼養(yǎng)21 d后統(tǒng)一處死小鼠。腹腔注射5%水合氯醛麻醉，在冰盤上迅速斷頸處死小鼠，取出完整腦組織，預(yù)冷的PBS漂洗2～3次，去除血污，置于EP管在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 小鼠脊髓組織病理檢測(cè) 處死小鼠后取脊髓組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制成切片。Luxol Fast Blue（LFB）染色觀察脫髓鞘改變：將石蠟切片依次放入二甲苯、乙醇脫蠟，醇化，加入LFB染液水浴后再次醇化，取出后放入分化液/乙醇分化，最后雙蒸水浸洗切片。在EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組標(biāo)本中分別隨機(jī)選取10張切片，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，進(jìn)行脫髓鞘評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：脊髓白質(zhì)內(nèi)藍(lán)色與背景色面積比進(jìn)行評(píng)分，0～19%為4分，20%～39%為3分，40%～59%為2分，60%～79%為1分；80%～100%為0分［7］。

1.7 Western blot 分析CNS 中MBP 的表達(dá) 取1.5 中備用的腦組織，剪碎，加入10倍體積的組織蛋白提取試劑，冰浴下勻漿。4 ℃下離心5 min，收集上清即為總蛋白溶液。BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣量約為40 μg，行SDS-PAGE 恒壓電泳（濃縮膠80 V、分離膠120 V），至溴酚藍(lán)到達(dá)膠板下沿。然后恒流（300 mA）轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入MBP一抗（1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶10 000），并在4 ℃中孵育過夜，用TBST洗滌3次，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶10 000），并在室溫下避光進(jìn)行孵育30 min，使用TBST洗滌4次，每次約5 min。ECL發(fā)光試劑盒暗室中曝光，完成最終顯影。使用AlphaEaseFC軟件對(duì)相應(yīng)蛋白的條帶光密度（OD）值進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 熒光定量PCR 法測(cè)定MBP 的mRNA 表達(dá)水平 取1.5中備用的腦組織約100 mg，使用TRIpure 試劑提取組織總RNA，根據(jù)M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑說明書操作得到cDNA 模板，利用QuFast SYBR Green Master Mix 熒光染料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增R-MBP 的基因片段。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

Tab.1 RT-PCR primer sequence表1 RT-PCR引物序列

反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃1 min；95 ℃15 s，58 ℃20 s，72 ℃45 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)液為：2×Master Mix 5.0 μL，引物工作液（2.5 μmol/L）1.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 2.0 μL，Rox 1.0 μL。最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包完成統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組計(jì)量資料均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠發(fā)病情況及神經(jīng)功能缺損評(píng)分 正常對(duì)照組未發(fā)病。EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組從7～8 d 開始不同程度發(fā)病，表現(xiàn)為活動(dòng)減少，食欲下降，精神萎靡；在12～16 d逐漸達(dá)到發(fā)病高峰，出現(xiàn)質(zhì)量不增甚至減低，共濟(jì)失調(diào)，尾部無(wú)力，肢體癱瘓。在發(fā)病觀察過程中，氯馬斯汀各劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于EAE模型組，見圖1。在發(fā)病高峰期（小鼠癥狀連續(xù)3 d 無(wú)進(jìn)展或死亡），與EAE 模型組相比，氯馬斯汀各劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯下降（P＜0.01）；且隨著干預(yù)劑量增大，神經(jīng)功能缺損評(píng)分減低，存在劑量依賴性（P＜0.01）。見表2。

Fig.1 Neurological deficit score of EAE group and three clemastine intervention groups圖1 EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分

Tab.2 Neurological deficit score of peak period and demyelination score in EAE group and three clemastine intervention groups表2 EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能缺損評(píng)分及脫髓鞘評(píng)分比較 （n=10，分，±s）

Tab.2 Neurological deficit score of peak period and demyelination score in EAE group and three clemastine intervention groups表2 EAE模型組和氯馬斯汀各劑量組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能缺損評(píng)分及脫髓鞘評(píng)分比較 （n=10，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與EAE 模型組比較，b與氯馬斯汀低劑量組比較，c與氯馬斯汀中劑量組比較，P＜0.05

組別EAE模型組氯馬斯汀低劑量組氯馬斯汀中劑量組氯馬斯汀高劑量組F發(fā)病高峰期評(píng)分3.800±0.537 3.200±0.421a 2.400±0.459ab 1.600±0.568abc 36.667＊＊脫髓鞘評(píng)分2.850±0.412 2.350±0.412a 1.800±0.537ab 1.100±0.516abc 25.230＊＊

2.2 小鼠脊髓組織學(xué)LFB 染色 正常對(duì)照組小鼠脊髓組織學(xué)正常，未發(fā)生脫髓鞘改變（脫髓鞘評(píng)分為0）。EAE模型組脊髓組織LFB染色可見髓鞘藍(lán)染區(qū)域的面積顯著減少，可見大面積髓鞘脫失后著色為白色的區(qū)域，即發(fā)生明顯脫髓鞘改變。氯馬斯汀各劑量組脫髓鞘程度較EAE 模型組好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步量化分析，與EAE 模型組小鼠比較，氯馬斯汀各劑量組小鼠脫髓鞘評(píng)分減低（P＜0.01）。且隨著干預(yù)藥物劑量增加，脫髓鞘評(píng)分逐漸降低（P＜0.01），呈劑量依賴性。見圖2、表2。

2.3 小鼠腦組織勻漿中MBP 蛋白及mRNA 表達(dá)水平 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，EAE模型組與氯馬斯汀各劑量組小鼠腦組織勻漿中的MBP 蛋白及mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與EAE 模型組比較，氯馬斯汀各劑量組小鼠腦組織勻漿中的MBP 蛋白及mRNA 表達(dá)水平顯著升高，且隨著氯馬斯汀藥物劑量的增加而增加，呈劑量依賴性（P＜0.05），見表3、圖3。

Tab.3 Comparison of MBP mRNA and protein expression levels in brain homogenate between five groups of mice表3 5組小鼠腦組織勻漿中MBP蛋白及其mRNA表達(dá)水平的比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of MBP mRNA and protein expression levels in brain homogenate between five groups of mice表3 5組小鼠腦組織勻漿中MBP蛋白及其mRNA表達(dá)水平的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對(duì)照組比較，b與EAE 模型組比較，c與氯馬斯汀低劑量組比較，d氯馬斯汀中劑量組比較，P＜0.05

組別正常對(duì)照組EAE模型組氯馬斯汀低劑量組氯馬斯汀中劑量組氯馬斯汀高劑量組F mRNA 1.002±0.069 0.471±0.050a 0.557±0.059ab 0.737±0.056abc 0.912±0.075abcd 129.557＊＊蛋白0.625±0.029 0.070±0.013a 0.124±0.034ab 0.296±0.021abc 0.504±0.036abcd 877.321＊＊

3 討論

3.1 CNS 脫髓鞘疾病再髓鞘化治療研究現(xiàn)狀 MS是最常見的CNS 脫髓鞘疾病，其疾病早期存在髓鞘修復(fù)，隨著病情進(jìn)展，軸突再髓鞘化將走向失敗，因此促進(jìn)OPCs成熟和髓鞘的再生將成為臨床治療MS新的重要靶點(diǎn)［8］。機(jī)體正常情況下，OPCs 在CNS 髓鞘脫失后出現(xiàn)遷移、增殖和分化形成OLs，修復(fù)CNS脫髓鞘，改善神經(jīng)功能障礙。目前研究已證實(shí)，調(diào)節(jié)OPCs 分化的抑制途徑主要包括Wnt、Notch、Lingo-1、BMP/Smad 通路；毒蕈堿受體、類視黃醇X 受體（retinol X receptor，RXR）、髓鞘基因調(diào)節(jié)因子和鋅指蛋白等信號(hào)通路則可以促進(jìn)OPCs的分化［9］。其中，OPCs 表達(dá)乙酰膽堿的毒蕈堿受體（muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs），故毒蕈堿通路是可以促進(jìn)OPCs分化的重要通路。研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6小鼠OPCs亦表達(dá)mAChRs；同時(shí)發(fā)現(xiàn)苯扎托品（一種毒蕈堿受體拮抗劑）在小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出強(qiáng)烈刺激OPCs分化和增殖的能力，在銅腙和PLP誘導(dǎo)的脫髓鞘動(dòng)物模型中均呈現(xiàn)出一定的治療作用，并推測(cè)其治療作用與直接拮抗OPCs中的膽堿活性從而促進(jìn)OPCs分化有關(guān)［10］。此前，氯馬斯汀為治療過敏及感冒癥狀的常用抗組胺藥，其同樣具有抗毒蕈堿作用，且能高效通過血腦屏障。Green等［11］將氯馬斯汀用于治療MS患者，但該研究沒有得出一個(gè)明顯的結(jié)論表明干預(yù)是否有效。也有研究發(fā)現(xiàn)，氯馬斯汀能夠在銅腙脫髓鞘模型中促進(jìn)小鼠髓鞘再生并改善小鼠神經(jīng)精神癥狀［12］。但是，近期美國(guó)的另一研究小組在針對(duì)佩梅?。≒elizaeus-Merzbacher disease，PMD）構(gòu)建的脫髓鞘動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，氯馬斯汀并未起到治療作用［13］，這可能與其特殊的疾病模型相關(guān)。基于以上的研究現(xiàn)狀，筆者選擇進(jìn)一步研究氯馬斯汀對(duì)EAE 小鼠脫髓鞘后再髓鞘化的影響。

Fig.2 LFB staining of spinal cord in five mouse groups(×200)圖2 小鼠脊髓組織學(xué)LFB染色（×200）

Fig.3 MBP expressions detected by Western blot assay圖3 Western blot測(cè)定MBP的表達(dá)

3.2 氯馬斯汀對(duì)EAE 小鼠的作用結(jié)果及其可能的機(jī)制 筆者以MOG35-55 為抗原誘發(fā)EAE 小鼠模型，該模型除研究MS 發(fā)病過程中的免疫機(jī)制，也常用于評(píng)估MS藥物的療效。本次研究對(duì)EAE模型小鼠予以氯馬斯汀腹腔注射預(yù)防性給藥干預(yù)，各劑量組的小鼠依然出現(xiàn)一定的神經(jīng)功能缺損癥狀，但其發(fā)病過程中的神經(jīng)功能缺損評(píng)分，尤其發(fā)病高峰期評(píng)分較EAE 模型組明顯降低，表明氯馬斯汀對(duì)EAE模型小鼠具有一定的防治作用。筆者對(duì)小鼠脊髓組織病理的LFB染色評(píng)估發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，氯馬斯汀各劑量組和EAE 模型組均存在脫髓鞘改變。氯馬斯汀各劑量組脫髓鞘程度較EAE 模型組明顯減輕，即氯馬斯汀的治療作用可能與通過改善受損軸突的脫髓鞘改變、促進(jìn)再髓鞘化有關(guān)。通過測(cè)定各組小鼠腦組織勻漿中MBP 及其mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示氯馬斯汀各劑量組較EAE 模型組MBP 及其mRNA 表達(dá)水平升高。而MBP 在CNS 中主要由成熟OLs合成，是髓鞘重要的結(jié)構(gòu)蛋白。由此認(rèn)為，氯馬斯汀可能的作用機(jī)制是在脫髓鞘病變中穿過血腦屏障，通過抗毒蕈堿作用促進(jìn)OPCs增殖分化為成熟OLs，上調(diào)MBP 的表達(dá)，修復(fù)受損髓鞘，實(shí)現(xiàn)再髓鞘化，從而改善小鼠癥狀。

3.3 結(jié)論與展望 綜上所述，氯馬斯汀對(duì)EAE小鼠存在防治作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。其可能通過抗毒蕈堿作用上調(diào)MBP 的表達(dá)，修復(fù)受損髓鞘，實(shí)現(xiàn)再髓鞘化。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)氯馬斯汀的作用靶點(diǎn)與當(dāng)前MS 以免疫修飾和免疫調(diào)節(jié)為主的治療策略不同。相信隨著再髓鞘化研究的不斷深入，基于毒蕈堿通路的相關(guān)藥物有望為MS 等脫髓鞘疾病的臨床治療提供新的方案。