楊雷，劉萍，劉暖，陶玲玲，毛秉豫

國家心血管病中心公布的2017 中國心血管病報告指出，心血管病死亡率無論在城市還是農(nóng)村，均高于所有其他疾病，其中，心肌梗死是引發(fā)死亡的重要原因之一，2015 年，急性心肌梗死患者的住院費用高達153.4 億元［1］。蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）廣泛參與多種細胞生理學(xué)進程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白輸送、增殖或凋亡等［2-3］，Ⅱa 類組蛋白去乙酰化酶5（Class Ⅱa histone deacetylase 5，HDAC5）是PKD1直接的下游靶標蛋白之一［2］。CID755673是經(jīng)典的PKD1的特異性阻斷劑，廣泛應(yīng)用于PKD1調(diào)控的信號通路的研究［4］。肌細胞增強因子2（myocyte enhancer 2，MEF2）是一種特定的促進肌細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，參與心肌的病理性重構(gòu)，與心肌梗死和心力衰竭存在著緊密聯(lián)系［5］。心肌肌鈣蛋白I（cTn I）對于心肌的收縮和舒張進程起著重要的作用，也是心肌梗死病理檢測中判定心肌壞死的金指標之一［6］。

本課題組近年來致力于以“PKD1”為靶點的心肌梗死等缺血性心肌病的治療研究，結(jié)果顯示PKD1具有誘導(dǎo)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞分化形成新生血管管腔的作用［7］，還同時有促心肌梗死大鼠心肌組織內(nèi)血管新生的作用［8］。本研究擬進一步探討PKD1/HDAC5軸在心肌梗死大鼠損傷心肌組織修復(fù)中的作用，為基于“PKD1”靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)繪制和新藥開發(fā)提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40 只雄性Wistar 大鼠，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，動物質(zhì)量合格證號：11400700315978。

1.1.2 藥物與試劑 PKD1（美國Pierce公司）；CID755673（北京孚博生物科技有限公司）；一抗兔抗HDAC5 多克隆抗體、兔抗MEF2多克隆抗體、兔抗cTn I多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz生物技術(shù)公司）；山羊抗兔IgG二抗（武漢三鷹生物技術(shù)公司）；TUNEL 染色試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 病理切片機（CUT6062 型，德國SLEE 公司）；勻漿機（T10 型，德國IKA 公司）；垂直型電泳儀（PowerPac HC 型，美國BD 公司）；熒光顯微鏡（Nikon Tis 型，日本尼康公司），配套分析軟件NIS-Elements Software BR。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建及動物分組 根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠劃分為4 組：假手術(shù)組、模型組、PKD1（2 mg·kg-1·d-1PKD1）組和阻斷劑CID755673（2 mg·kg-1·d-1PKD1+10 ng·kg-1·d-1CID755673）組，每組10 只。模型組采用經(jīng)典的左冠狀動脈結(jié)扎術(shù)復(fù)制心肌梗死模型，假手術(shù)組開胸手術(shù)但沒有進行結(jié)扎處理。模型組和假手術(shù)組均給予同劑量的生理鹽水。尾靜脈注射，隔日1次，持續(xù)28 d。

1.2.2 HE染色 28 d后處死大鼠，取心尖部心肌組織，置入4%多聚甲醛浸泡固定12 h后，制作厚度為3～4 μm的組織切片，石蠟包埋作常規(guī)HE 染色，400 倍放大后取5 個不同視野觀察分析。

1.2.3 Masson染色 心肌組織應(yīng)用堿性品紅和苯胺藍染色，光學(xué)顯微鏡下心肌組織染色為紅色，膠原纖維為藍綠色。采用NIS-Elements Software BR 軟件計算膠原容積分數(shù)（CVF），CVF=同一圖像視野下的膠原面積/該視野的總面積。

1.2.4 TUNEL 染色 取和HE 染色一致的石蠟切片，參照TUNEL 試劑盒說明書染色，細胞核DAPI 復(fù)染。熒光顯微鏡下正常細胞示藍色，陽性凋亡心肌細胞示紅色。每張切片選5個非重復(fù)視野，統(tǒng)計陽性細胞個數(shù)。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 組織取材同HE 染色。脫蠟、水化、H2O2祛除組織玻片上的過氧化物酶活性后，抗原修復(fù)，山羊血清封閉后加入一抗HDAC5（1∶50）、MEF2（1∶200）、cTn I（1∶200）或β-actin（1∶100），4 ℃下孵育過夜，PBS 沖洗3 次；加入IgG二抗（1∶2 000），室溫下作用15 min。DAB顯色后鏡下觀察，陽性的細胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色。400倍視野下取5個不重復(fù)視野/切片，計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

1.2.6 免疫印跡檢測 取心尖部心肌組織，IKA-T10勻漿機制成組織勻漿后，BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，添加一抗HDAC5（1∶500）、MEF2（1∶200）、cTn I（1∶1 000）或β-actin（1∶200），4 ℃下孵育12 h，PBS液清洗3次，與IgG二抗（1∶2 000）孵育1 h后TBST洗膜，暗室曝光顯影。計算并記錄各樣本蛋白與β-actin灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織病理變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織細胞形態(tài)清晰，核占據(jù)細胞中央，心肌纖維中可見粉紅色閏盤橫貫和不同數(shù)量的毛細血管散布。模型組大鼠心肌組織呈現(xiàn)壞死組織典型特征：心肌纖維斷裂，細胞核模糊或消散，閏盤和橫紋消失，伴炎癥細胞浸潤和瘢痕組織增生。PKD1 組大鼠心肌壞死區(qū)域明顯減少，閏盤和橫紋可見，細胞核清晰，但略顯肥大，心肌纖維內(nèi)毛細血管和紅細胞數(shù)量增多。CID755673組大鼠心肌組織梗死范圍和模型組相似，細胞核溶解消失明顯，可見明顯的瘢痕組織和炎癥細胞。見圖1A。Masson染色結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠心肌呈現(xiàn)規(guī)整的大片紅色心肌，間雜少量藍色的膠原纖維；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌藍色膠原纖維占比過半，CVF 值顯著升高（P＜0.05），少量紅色心肌散在分布；與模型組相比，PKD1 組大鼠以紅色心肌為主，藍色膠原纖維占比較低，CVF值顯著下降（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠心肌藍色膠原纖維占比較高，CVF 值顯著升高（P＜0.05），見圖1B、表1。

Tab.1 Effects of PKD1 on collagen volume fraction and apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction表1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織的膠原容積分數(shù)和心肌細胞凋亡數(shù)量的影響 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of PKD1 on collagen volume fraction and apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction表1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織的膠原容積分數(shù)和心肌細胞凋亡數(shù)量的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與PKD1 組比較，P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組PKD1組CID755673組F CVF（%）12.26±2.86 65.54±12.98a 13.52±2.82b 63.37±13.12ac 99.496＊＊TUNEL陽性細胞（個/視野）4.05±2.45 35.82±12.52a 4.36±2.48b 34.48±13.36ac 36.789＊＊

2.2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡變化的影響 TUNEL 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠鏡下視野表現(xiàn)以藍色熒光為主的正常心肌細胞，偶見發(fā)出紅色熒光的凋亡細胞；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視野中呈現(xiàn)紅色熒光的凋亡細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05）；與模型組相比，PKD1組大鼠呈現(xiàn)以藍色熒光為主的心肌細胞居多，凋亡細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠呈紅色熒光的凋亡細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 PKD1 對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I蛋白表達的影響 免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織內(nèi)HDAC5 和MEF2 陽性細胞的數(shù)量均較少，而cTn I 陽性細胞的數(shù)量較多；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠殘存心肌組織內(nèi)MEF2 陽性細胞的數(shù)量顯著增多（P＜0.05），而cTn I陽性細胞的數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，PKD1組大鼠心肌組織內(nèi)MEF2陽性細胞的數(shù)量顯著減少（P＜0.05），而HDAC5 和cTn I 陽性細胞的數(shù)量均顯著升高（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠MEF2 陽性細胞的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），而HDAC5 和cTn I 陽性細胞的數(shù)量均顯著減少（P＜0.05）。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，HDAC5、MEF2 和cTn I 蛋白表達的變化趨勢和免疫組化結(jié)果相一致。見表2，圖3、4。

Fig.3 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction圖3 PKD1對心梗大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（免疫印跡）

3 討論

研究表明，心肌梗死后心肌細胞出現(xiàn)大量壞死和凋亡，肉芽組織機化取代壞死的心肌組織，心梗后3～4 周，肉芽組織轉(zhuǎn)變成瘢痕組織［9］，這與本研究模型組大鼠心肌組織病理變化相一致。心肌組織發(fā)生壞死、凋亡及瘢痕組織出現(xiàn)等病理變化嚴重影響著心肌細胞的能量代謝，破壞心肌組織的微血管，進而導(dǎo)致殘存的心肌細胞負荷加重，心肌細胞肥厚，肥厚的心肌細胞缺氧變性壞死、纖維化，進而引發(fā)心室重構(gòu)，嚴重者進展為心力衰竭?；诖?，減少心肌細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肥厚心肌以及減輕心肌纖維化進而逆轉(zhuǎn)重構(gòu)的心室是治療心肌梗死的重要策略之一［10-11］。

Tab.2 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction表2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（n=10，±s）

Tab.2 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction表2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與PKD1組比較，P＜0.01

組別假手術(shù)組模型組PKD1組CID755673組F陽性細胞（個/視野）HDAC5 10.56±5.12 9.68±5.24 42.82±5.44ab 9.74±5.48c 95.172＊＊MEF2 14.48±6.56 48.54±6.76a 13.96±6.82b 46.62±6.64ac 82.896＊＊cTn I 75.65±11.25 18.88±10.84a 73.23±11.12b 19.44±10.76c 84.355＊＊蛋白表達（目的蛋白/β-actin）HDAC5 0.15±0.04 0.14±0.08 0.64±0.09ab 0.16±0.06c 121.094＊＊MEF2 0.26±0.12 0.72±0.16a 0.24±0.14b 0.74±0.18ac 33.538＊＊cTn I 0.82±0.18 0.39±0.12a 0.69±0.16ab 0.38±0.14ac 21.057＊＊

筆者前期研究顯示，PKD1具有上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達和促進缺血心肌組織血管新生的作用［7-8,12］。本實驗的HE 染色結(jié)果證實，PKD1 組大鼠心肌組織內(nèi)微血管和紅細胞數(shù)量均顯著增多，這與前期的研究結(jié)果相一致。Masson 染色結(jié)果證實，PKD1 組大鼠紅色心肌所占比例顯著升高；TUNEL染色結(jié)果證實，PKD1治療后心肌組織內(nèi)凋亡的心肌細胞數(shù)量顯著減少。這表明，PKD1可能通過促進心肌梗死后心肌組織內(nèi)新生血管的生成，增加心肌的微循環(huán)血供，從而使心肌細胞的凋亡數(shù)量下降，并減輕心肌的壞死和纖維化程度，修復(fù)缺血受損的心肌。PKD1的特異性阻斷劑CID755673可阻斷PKD1的上述有益作用，進一步表明PKD1 可能是促心肌梗死后缺血受損心肌修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。

心肌細胞內(nèi)的HDAC5 在正常情況下位于細胞核內(nèi)，主要處于脫磷酸化失活狀態(tài)［2］，本實驗的免疫組化染色結(jié)果也證實了假手術(shù)組大鼠HDAC5 位于心肌細胞核內(nèi)，但幾乎不表達。PKD1必須和其靶標蛋白HDAC5結(jié)合才能參與正常的生理活動，因此形成了一種特異的PKD1/HDAC5 軸［2-3］。PKD1/HDAC5 軸在心肌梗死后心肌組織修復(fù)中的作用之前少有報道。本研究中，模型組大鼠HDAC5的表達與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在PKD1 的誘導(dǎo)干預(yù)下，HDAC5 的表達顯著上調(diào)，而CID755673 能夠阻斷PKD1誘導(dǎo)的HDAC5上調(diào)。這表明，HDAC5是在PKD1的調(diào)控作用下發(fā)揮生物學(xué)作用的。

HDAC5 激活后結(jié)合MEF2 并抑制MEF2 的表達進而抑制心肌細胞發(fā)生病理性肥大，參與逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥厚的進程［13］。MEF2 能夠調(diào)控影響心肌細胞核轉(zhuǎn)位、細胞骨架重塑和線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整性的特異性相關(guān)基因表達，MEF2的表達上調(diào)會引發(fā)心肌的收縮和舒張功能障礙，心室腔擴張，心室重構(gòu)，最終發(fā)生心力衰竭［14］。MEF2 還參與心肌的纖維化重塑進程，壓力負荷引發(fā)心室重構(gòu)的動物模型實驗表明，敲除MEF2 基因的小鼠較未敲除的小鼠纖維化程度明顯減輕［15］。MEF2 還具有調(diào)控脂肪酸的氧化而影響線粒體的功能，進而影響心肌的能量代謝［16］。這表明，MEF2在心肌梗死、心功能衰竭等疾病進程中均發(fā)揮著重要的作用。本實驗中假手術(shù)組大鼠沒有受到病理性或者藥物干預(yù)性刺激時，MEF2表達很低；模型組大鼠殘存的心肌細胞明顯肥大，心肌纖維化程度明顯，且伴隨著MEF2 表達的顯著升高，這與Tóth 等［13］報道的研究結(jié)果相一致。PKD1干預(yù)后MEF2表達顯著下調(diào)，而CID755673能夠阻斷這一作用。這表明，PKD1 可能通過結(jié)合HDAC5 而抑制MEF2的表達進而逆轉(zhuǎn)心肌梗死后心室重構(gòu)等不良反應(yīng)，促進心肌梗死后受損心肌的修復(fù)。

cTn I是判定心肌損傷的金指標之一［6］。本研究顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，cTn I 的表達也最高；模型組大鼠心肌組織損傷明顯，因而cTn I 表達顯著降低。PKD1 干預(yù)后cTn I 表達再次顯著升高，而CID755673可以阻斷cTn I 表達的升高。這表明，PKD1 與HDAC5 結(jié)合激活后可以促進損傷心肌的修復(fù)。這為基于“PKD1”靶點的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和基于“PKD1”靶點開發(fā)治療心肌梗死的新藥提供了部分實驗數(shù)據(jù)支持。下一步的研究中，需要設(shè)計siPKD1，并以CID755673做對照，從細胞實驗水平進一步探討PKD1/HDAC5軸的生物學(xué)作用。

Fig.1 Effects of PKD1 on histopathological changes in rats with myocardial infarction圖1 PKD1對心肌梗死大鼠組織病理變化的影響

Fig.2 Effects of PKD1 on apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction圖2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡變化的影響（標尺為40 μm）

Fig.4 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I of myocardium in rats with myocardial infarction(Scale bar=40 μm)圖4 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（免疫組化，標尺為40 μm）