張杰，唐橋斐

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是較為常見的惡性腫瘤，每年在全球可造成30多萬人死亡，其發(fā)病率仍不斷上升［1］。下咽鱗狀細(xì)胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC）是HNSCC 中致死率最高的一種，據(jù)報(bào)道5 年存活率僅為30%［2］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類功能性非編碼RNA分子［3］，可通過多種途徑參與生物體的關(guān)鍵生理生化過程，包括多種癌癥［4］。尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）被證明是一種膀胱癌特異性lncRNA［5］，在肝細(xì)胞癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和胃癌中的表達(dá)呈上調(diào)趨勢［6］，但目前關(guān)于lncRNA UCA1 在HSCC 中發(fā)揮的作用及機(jī)制的研究較少。因此，本研究將主要探討lncRNA UCA1 對HSCC FaDu 細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及周期的影響，為HSCC診斷和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人咽鱗癌細(xì)胞系FaDu 購自于中喬新舟，細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 MEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（Hyclone，美國），脂質(zhì)體2000（Invitrogen，美國），胰酶（碧云天，上海），UCA1 siRNA 及NC siRNA（UCA1 siRNA 序列為Sense 5' -GUUCACCAUUCCAGAAUAATT-3' ，Anti-Sense 5'-UUAUUCUGGAAUGGUGAACTT-3'；NC siRNA 序列為Sense 5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' ，Anti-Sense 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；吉瑪制藥，上海），CCK-8（萬類生物，沈陽），TRIpure、Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、2×Power Taq PCR MasterMix、SYBR Green（BioTeke，北京），細(xì)胞周期檢測試劑盒（碧云天，上海），Transwell 小室（Corning，美國），結(jié)晶紫（Amresco，美國），全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒以及Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase 9、cyclin D1、PCNA抗體（萬類生物，沈陽）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將FaDu細(xì)胞分為3組，Control組為未轉(zhuǎn)染組，si-NC 組為轉(zhuǎn)染NC siRNA 組，si-UCA1 組為轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA 組。未轉(zhuǎn)染組不做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對si-NC 組及si-UCA1組的細(xì)胞進(jìn)行如下操作：待細(xì)胞生長至70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，將脂質(zhì)體2000 和siRNA 試劑于室溫混勻，然后將混合液加至細(xì)胞中于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，然后更換為完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Real-time PCR 檢測 收集轉(zhuǎn)染siRNA后的3組細(xì)胞，根據(jù)TRIpure 試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，使用紫外分光光度計(jì)NANO 2000 測定各樣本中RNA 的濃度及純度，然后將RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA 為模板擴(kuò)增UCA1（引物序列上游：5'-CATTCAGACCGCCACTCA-3'；下游：5'-CCAGTTAGCGTATTTTTGAGC-3'）及β-actin（引物序列上游：5'- ACCCTGAAGTACCCCATCGA -3' ；下游：5' -CAAACATGATCTGGGT CATCT-3'）；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)利用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將FaDu細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)為3×103個(gè)，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h 后，棄去上清，每孔加入100 μL 完全培養(yǎng)基及10 μL CCK-8，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell檢測細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用40 μL預(yù)先稀釋好的Matrigel膠包被小室，然后將Transwell小室放入24孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，向上室中加入1×105/孔的細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后取出24孔板，將Transwell 小室用PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染液染色5 min，蒸餾水清洗后在倒置顯微鏡下（×200）對侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集細(xì)胞后用70%乙醇在4 ℃下固定2 h，用碘化丙啶和RNase A 處理細(xì)胞，在37 ℃環(huán)境下避光溫育30 min，隨后進(jìn)行流式檢測。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 離心收集細(xì)胞，利用全蛋白提取試劑盒以及BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取和定量，蛋白樣品調(diào)至等量（40 μg）后經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，然后在80 V電壓下濕轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（Bax 抗體、Bcl-2 抗體、cleaved-Caspase 9 抗體、cyclin D1 抗體、PCNA 抗體分別以1∶500 比例稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜4 次，每次5 min，HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000 稀釋）37 ℃孵育45 min，TBST 洗膜6 次，每次5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR 檢測轉(zhuǎn)染siRNA 后lncRNA UCA1 的表達(dá)水平 3 組間細(xì)胞的lncRNA UCA1 表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=742.76，P＜0.01），si-UCA1 組細(xì)胞的lncRNA UCA1 表達(dá)水平（0.25±0.02）較Control 組（1.00±0.02）、si-NC 組（0.92±0.04）顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，除0 h各組OD 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)si-UCA1組的OD值均顯著低于Control 組及si-NC 組（P＜0.05），Control 組及si-NC組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the proliferation of FaDu cells表1 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞增殖的影響（n=5，OD值，±s）

Tab.1 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the proliferation of FaDu cells表1 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞增殖的影響（n=5，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與si-NC 組比較，P＜0.05；表2～4同

組別Control組si-NC組si-UCA1組F 0 h 0.23±0.03 0.22±0.02 0.22±0.03 0.369 24 h 0.37±0.06 0.33±0.05 0.26±0.05ab 5.881＊48 h 0.55±0.06 0.58±0.06 0.38±0.04ab 18.861＊＊組別Control組si-NC組si-UCA1組F 72 h 0.62±0.06 0.64±0.06 0.45±0.06ab 13.317＊＊96 h 0.67±0.05 0.64±0.07 0.48±0.61ab 12.875＊＊120 h 0.68±0.07 0.67±0.07 0.51±0.06ab 10.256＊＊

2.3 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Control 組及si-NC 組比較，si-UCA1 組G1 期細(xì)胞比例顯著增加，S 期和G2 期細(xì)胞比例顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表2。

Fig.1 The effect of si-UCA1 on FaDu cell cycle detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測si-UCA1對FaDu細(xì)胞周期的影響

Tab.2 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the cell cycle of FaDu cells表2 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞周期的影響（n=3，%，±s）

Tab.2 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the cell cycle of FaDu cells表2 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞周期的影響（n=3，%，±s）

組別Control組si-NC組si-UCA1組F G1 67.27±0.91 66.30±3.11 75.27±1.42ab 17.413＊＊S 13.64±0.85 13.83±0.67 7.68±0.76ab 63.185＊＊G2 16.53±0.47 16.27±0.48 14.30±0.55ab 17.791＊＊

2.4 下調(diào)lncRNA UCA1 表達(dá)對細(xì)胞凋亡、周期、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組及si-NC 組比較，si-UCA1 組細(xì)胞中Bax、cleaved-Caspase 9 蛋白水平顯著升高，Bcl-2、cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Western blot analysis of the effects of si-UCA1 on protein expression levels of Bax,Bcl-2,cleaved-Caspase 9,cyclin D1 and PCNA in FaDu cell line圖2 Western blot檢測si-UCA1對FaDu細(xì)胞系中Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase 9、cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞侵襲的影響 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后的各組間侵襲細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)48 h后，si-UCA1組侵襲細(xì)胞數(shù)量較Control組、si-NC組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3、表4。

3 討論

HSCC 是致死率極高的頭頸部惡性腫瘤，由于HSCC早期癥狀不明顯，大多患者在確診時(shí)就已處于疾病晚期。目前對于HSCC的治療手段多為手術(shù)治療，但多預(yù)后不良［7］。因此，探索HSCC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，盡早發(fā)現(xiàn)HSCC 特異性腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對HSCC的診斷、治療及預(yù)后意義重大。

Tab.3 The effects of si-UCA1 on apoptosis,cell cycle and proliferation related protein expressions表3 si-UCA1對細(xì)胞凋亡、周期、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）

Tab.3 The effects of si-UCA1 on apoptosis,cell cycle and proliferation related protein expressions表3 si-UCA1對細(xì)胞凋亡、周期、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）

組別Control組si-NC組si-UCA1組F Bax 0.43±0.01 0.43±0.02 1.07±0.05ab 407.764＊＊Bcl-2 0.98±0.03 1.03±0.04 0.52±0.03ab 230.117＊＊組別Control組si-NC組si-UCA1組F cleaved-Caspase 9 0.48±0.04 0.51±0.04 1.01±0.02ab 237.640＊＊cyclin D1 0.54±0.07 0.45±0.03 0.25±0.02ab 34.329＊＊PCNA 0.59±0.07 0.61±0.04 0.32±0.07ab 21.545＊＊

Tab.4 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the invasion of FaDu cells表4 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞侵襲的影響（n=5，個(gè)/視野，±s）

Tab.4 The effect of downregulation of lncRNA UCA1 expression on the invasion of FaDu cells表4 下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)對FaDu細(xì)胞侵襲的影響（n=5，個(gè)/視野，±s）

組別Control組si-NC組si-UCA1組F 24 h 41.2±5.3 40.8±5.9 36.4±5.3 1.180 48 h 62.2±9.2 69.0±7.5 36.0±4.4ab 28.697＊＊

UCA1 是最先從膀胱癌細(xì)胞系BLZ-211 中克隆和鑒定的一種膀胱癌特異的lncRNA，被證實(shí)是膀胱腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的重要調(diào)節(jié)者［5］。研究顯示lncRNA UCA1 可能參與了多種癌癥的疾病進(jìn)展，例如Wang等［8］研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)lncRNA UCA1可通過抑制miR-216b 和激活FGFR1/ERK 信號通路，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展。本研究通過基因沉默技術(shù)抑制人咽鱗癌FuDa細(xì)胞中l(wèi)ncRNA UCA1的表達(dá)，然后觀察細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期分布的變化。細(xì)胞周期是一個(gè)高度有序的生物系統(tǒng)，調(diào)控著細(xì)胞的增殖分化，以往研究顯示lncRNA UCA1可能參與了細(xì)胞周期調(diào)控。例如Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1 可通過抑制細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p27的表達(dá)促進(jìn)乳腺腫瘤生長。在本研究中，抑制lncRNA UCA1 的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞大量阻滯于G1期，Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白cyclin D1、PCNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)。Wei等［10］也證明了lncRNA UCA1的缺失參與了黑色素瘤的細(xì)胞周期阻滯，與本研究結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，是誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的重要機(jī)制，有研究認(rèn)為lncRNA UCA1可通過抑制miR-184 的表達(dá)促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡［11］。本研究也證明了lncRNA UCA1 對人咽鱗癌細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，在FuDa 細(xì)胞中下調(diào)UCA1 表達(dá)后，促凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-Caspase 9 表達(dá)水平升高，抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)下降，說明lncRNA UCA1 表達(dá)缺失可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。細(xì)胞侵襲是促使腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，本研究通過Transwell 實(shí)驗(yàn)證明了抑制lncRNA UCA1 可顯著抑制人咽鱗癌細(xì)胞的侵襲能力，佐證了Gong等［12］認(rèn)為lncRNA UCA1 參與了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)。除此之外，lncRNA UCA1 在胃癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌等癌癥中異常表達(dá)，并與癌癥預(yù)后密切相關(guān)［13-14］，lncRNA UCA1 還被認(rèn)為是急性心肌梗死的一個(gè)新的標(biāo)志物［15］，提示其可能成為潛在標(biāo)志物，為多種疾病的診斷及預(yù)后提供幫助。

Fig.3 Results of Transwell assay of the effect of si-UCA1 on invasion of FaDu cells（crystal violet，×200）圖3 Transwell檢測si-UCA1對FaDu細(xì)胞侵襲的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

本次研究從細(xì)胞水平說明了下調(diào)lncRNA UCA1表達(dá)可以抑制FuDa 細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為lncRNA UCA1 調(diào)控HSCC 疾病進(jìn)展提供了新的理論依據(jù)。但本次研究并未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，無法確定在體內(nèi)抑制lncRNA UCA1表達(dá)對HSCC的調(diào)控作用，故lncRNA UCA1 調(diào)控HSCC 發(fā)生發(fā)展的作用及機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探究。