王蕾，霍景瑞，張國安，賈力，田毅，楊曉暉，張晶晶，劉穎，吳楠，劉英富，3△

重鏈抗體是一種存在于駱駝體內的只有兩條重鏈組成的抗體結構，其重鏈的可變區(qū)是抗原結合的關鍵區(qū)，在單獨存在的情況下，同樣具有抗原結合的能力，由于重鏈抗體的可變區(qū)分子直徑小于100nm，并具備抗原結合能力，因此該結構又被稱為納米抗體［1］?？贵w能夠與抗原結合，發(fā)揮檢測和拮抗抗原的功能，抗獨特型抗體研究發(fā)現，抗體同樣可以作為抗原刺激機體產生針對抗體的抗體［2-3］，抗體用作抗原進行免疫產生抗體反應，與抗體的可變區(qū)關系密切，納米抗體作為小分子抗體，具有穩(wěn)定性強、親和力高、可溶性好等優(yōu)勢［4-5］，在疾病的診斷、檢測等領域已得到廣泛應用［6-9］，而納米抗體作為抗原表位展示載體少有報道，本研究以β-人絨毛膜促性腺激素（β human chorionic gonadotropin，β-HCG）為研究靶蛋白，將β-HCG的C端短序列構建到納米抗體可變區(qū)的CDR3 區(qū)，評估納米抗體進行表位展示的方法在抗體制備中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌BL21（DE3）、PET24a 表達載體為本實驗室保存，引物、展示β-HCG C 端表位（氨基序列151～165）的納米抗體基因（Nb-HCGβe）由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成；內切酶、膠回收試劑盒、DNA 連接酶、DL2000、蛋白Marker、大鼠抗兔二抗均購自北京康為世紀生物科技有限公司；非小細胞肺癌細胞株A549、Nb-HCGβe 偶聯凝膠介質購自天津泰克迪恩生物科技有限公司；α-HCG、β 促黃體生成素（β Luteinizing hormone，β-LH）蛋白購自北京景達生物科技有限公司，β-HCG 由本實驗室表達純化。新西蘭大耳白兔購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004；免疫佐劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 β-HCG 表位選擇與Nb-HCGβe 基因合成 納米抗體為前期實驗室采集羊駝外周血分離淋巴細胞，設計引物擴增并測序得到的多個納米抗體序列中，隨機抽取其中一個納米抗體作為表位展示載體。選擇β-HCG C 末端（氨基序列151～165）15 個氨基酸長度，通過基因合成的方式，插入到納米抗體CDR3 區(qū)，合成含β-HCG C 端表位的納米抗體（Nb-HCGβe）基因，合成的基因含EcoRⅠ、XhoⅠ兩個酶切位點。

1.2.2 Nb-HCGβe 載體構建、表達、純化 將合成的Nb-HCGβe 基因、原核表達載體pET24a 分別用內切酶進行雙酶切，酶切產物分別膠回收，連接酶連接，連接產物轉化BL21（DE3）宿主菌，挑單克隆菌液PCR 鑒定，將鑒定陽性的宿主菌進一步測序鑒定。測序正確的樣品，37 ℃搖菌培養(yǎng)，OD600達到0.8時，加入0.1 mmol/L IPTG誘導4 h，誘導結束后，冰浴超聲破碎大腸桿菌（超聲條件：功率400 W，工作5 s，間隔5 s，時長3 min），超聲后樣品12 000 r/min 離心10 min，分別收集上清、沉淀，SDS-PAGE電泳觀察超聲后上清、沉淀蛋白表達情況，根據表達結果，大量制備Nb-HCGβe，His 標簽金屬螯合親合層析填料進行純化。

1.2.3 Nb-HCGβe 免疫及血清效價檢測 月齡3 個月，體質量1.5 kg 的大耳白兔2 只，飼養(yǎng)1 周開始免疫，Nb-HCGβe 抗原600 μg/只，初次免疫，弗氏完全佐劑蛋白乳化，皮下多點注射，初次免疫之后第14、21、28、35天采用弗氏不完全佐劑蛋白乳化，腹腔注射免疫，最后1 次免疫結束1 周后，取血檢測效價，效價達到1∶100 000以上，視為免疫成功。

1.2.4 Nb-HCGβe 多抗純化及效價檢測 采集免疫成功的兔外周血，離心收集上清并與結合緩沖液1∶1 混合，0.45 μm濾器過濾，上樣過Nb-HCGβe 偶聯介質，結合緩沖液沖洗柱至檢測器基線，0.1 mol/L Glycine-HCl（pH=2.7）洗脫液洗脫，洗脫樣品用1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH=9.0）快速中和。純化的抗體SDS-PAGE 蛋白電泳，檢測抗體的純化效果，酶聯免疫吸附測定（ELISA）法進一步檢測純化抗體的效價，以未免疫的兔多抗作為對照。

1.2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 特異性檢測 檢測樣品含Nb-HCGβe、β-HCG、A549細胞裂解液、α-HCG、β-LH、不含HCG 表位的納米抗體做對照（Nb-C），SDS-PAGE 蛋白電泳，電泳結束后，電轉PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，Nb-HCGβe偶聯介質純化的抗體作為一抗（1∶10 000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，二抗（1∶10 000 稀釋）37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入發(fā)光液檢測，未免疫血清為對照。

2 結果

2.1 Nb-HCGβe 載體構建及鑒定 通過基因合成的方式，將β-HCG C 端序列插入到納米抗體的CDR3區(qū)，合成的Nb-HCGβe雙酶切后，連接pET24a原核表達載體并轉化BL21（DE3）宿主菌，挑取4 個生長菌落進行菌液PCR鑒定，結果顯示：4個菌落中1 個未見條帶，3 個出現陽性條帶，與預測大小一致（396 bp），見圖1。3個陽性克隆中，隨機挑取1個送檢測序，測序結果正確。

圖1 Nb-HCGβe 菌液PCR鑒定

2.2 Nb-HCGβe 表達、純化 Nb-HCGβe 經原核表達和IPTG 誘導后，SDS-PAGE 蛋白電泳結果顯示，Nb-HCGβe轉化BL21（DE3）誘導后，在15 ku位置有目的條帶表達，經超聲破碎處理，表達的蛋白主要存在超聲沉淀中，以包涵體的形式存在，見圖2A。經包涵體洗滌，將8 mol/L 尿素裂解的蛋白進行His 標簽純化，經低濃度（5、10、20 mmol/L）咪唑去除雜蛋白，高濃度（100 mmol/L）咪唑洗脫獲得目的蛋白純度大于98%，見圖2B。

2.3 Nb-HCGβe血清效價檢測 純化的Nb-HCGβe經復性處理后，免疫新西蘭大耳白兔，免疫5 次后，第6 周耳緣靜脈采集外周血，采用間接ELISA 法進行效價檢測，2 只免疫后的兔血清效價均可達到1∶512 000，見圖3。

Fig.2 Expression and purification of Nb-HCGβe圖2 Nb-HCGβe的表達、純化

Fig.3 Titer detection of Nb-HCGβe immune serum圖3 Nb-HCGβe 免疫血清效價檢測

2.4 Nb-HCGβe 免疫血清純化及檢測 免疫后的兔血清，抗原偶聯介質純化，得到抗Nb-HCGβe多抗（pAn-Nb-HCGβe），SDS-PAGE 電泳檢測抗體純化效果，能明顯觀察到重鏈、輕鏈兩條帶，見圖4A，純化后的抗體倍比稀釋，抗體濃度約為0.02 mg/L 時，仍能夠檢測到陽性反應，見圖4B。

2.5 Nb-HCGβe 多抗Western blot 鑒定 Western blot結果顯示，pAn-Nb-HCGβe能夠特異性結合Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細胞裂解液中的β-HCG，與α-HCG、β-LH 未發(fā)生結合反應，見圖5A，Nb-HCGβe 免疫血清可以檢測到與Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細胞裂解液4 個樣品的陽性反應，同樣未檢測出α-HCG、β-LH，見圖5B，對照血清與上述樣品均未反應。

Fig.4 Purification and detection of antibody Nb-HCGβe圖4 Nb-HCGβe抗體純化及測定

Fig.5 Western blot specific detection of Nb-HCGβe antibody圖5 Nb-HCGβe抗體免疫印跡特異性檢測

3 討論

抗體在疾病的診斷、治療及基礎研究方面發(fā)揮著日益重要的作用，抗體的制備研究對推動生命科學發(fā)展具有重要意義。在抗體制備過程中，抗原是抗體制備的基礎，天然蛋白是抗體制備的理想抗原，然而由于天然蛋白往往存在著提取、表達、復性困難等各種各樣的問題，以載體蛋白表位展示、噬菌體表位展示為代表的多種展示技術在抗原替代研究中得到廣泛應用［10-11］。

匙孔血藍蛋白（KLH）、雞卵白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）是常用的展示載體［12-14］，但這些載體在表位展示時需要較復雜的表位偶聯過程，為抗原的表位展示帶來了不便。抗體作為抗原表位展示工具，在眾多表位展示載體中具有較大優(yōu)勢，如抗體可變區(qū)本身就是多變的結構序列，其序列的變化不影響抗體結構的穩(wěn)定性，具有較好的表位展示功能?？贵w種類多樣，包含傳統(tǒng)重鏈、輕鏈組成的四鏈抗體、單鏈抗體、納米抗體等類型，傳統(tǒng)抗體、單鏈抗體都有相關抗原表位展示的研究報道［2-3］。而納米抗體用來展示抗原表位少有報道，納米抗體CDR3 區(qū)結構比傳統(tǒng)抗體的相應區(qū)域要較長，彌補了輕鏈缺失造成的抗原結合力下降，同時較長的CDR3 區(qū)對抗體的免疫原性具有重要的貢獻作用［4］，更加適合用于抗原表位的展示，同時納米抗體分子質量小，產生的無關抗體相對較少，易于單克隆抗體的篩選，是較為理想的表位展示載體。

為驗證納米抗體CDR3 區(qū)表位的展示功能，本研究以β-HCG 為研究對象，進行其抗體的制備研究。HCG 分為a、β 兩個亞單位，α 亞基與垂體分泌的β-LH、卵泡刺激素（FSH）、促甲狀腺激素（TSH）結構基本相似，β-HCG與β-LH結構相近，其中游離β-HCG 的升高與乳腺癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關［15-17］，是多種腫瘤的標志物，通過檢測血液β-HCG的變化，可提高腫瘤診斷的準確性。

β-HCG與β-LH結構相近，但β-HCG羧基端最后24 個氨基酸延長部分在β-LH 中不存在，為提高檢測的特異性，本研究選擇β-HCG羧基端特異性結構序列，通過基因合成的方式，將β-HCG 羧基端序列插入到納米抗體的CDR3 區(qū)進行原核表達，雖然納米抗體具有較好的可溶性［18］，而本研究在進行表達時發(fā)現，構建的含β-HCG表位的納米抗體在表達時主要是包涵體的形式，可能與表達載體有很大的關系。本研究選擇的PET24a 表達系統(tǒng)有較強的原核表達能力，載體表達量大、表達速度快，可能是影響其可溶性的主要原因。雖然表達的Nb-HCGβe為包涵體，為了使β-HCG抗原表位能夠以空間結構的形式存在，本研究對包涵體做了復性處理，由于納米抗體具有較高的水溶性，易于復性，將復性的蛋白免疫動物，獲得了針對Nb-HCGβe的多抗。

在對多抗的檢測中，本研究選擇了Nb-C、Nb-HCGβe、β-HCG、A549 細胞裂解液、α-HCG、β-LH進行了特異性檢測。而在檢測過程中需要注意，β-HCG 由165 個氨基酸組成，分子質量理論預測值為18.1 ku，而由于其高度的糖基化，其實際分子質量約為22.2 ku。Western blot 檢測結果顯示，Nb-HCGβe偶聯介質純化獲得的多抗僅能夠檢測到Nb-HCGβe、β-HCG、A549細胞裂解液陽性反應，而未純化的免疫血清不但能夠檢測上述3 種樣品，還可以檢測不含β-HCG 表位的Nb-C 對照納米抗體，提示納米抗體作為展示載體展示時，不但產生了針對CDR3區(qū)表位的抗體，同樣產生了針對納米抗體其他部位的抗體。

綜上所述，本研究采用納米抗體展示β-HCG抗原表位的方法，能夠制備針對完整β-HCG 的抗體，在此基礎上，今后將圍繞單克隆抗體篩選及抗體標記技術，開展相關的研究，同時，由于自然界抗原種類多種多樣、蛋白結構復雜多變，該方法能否適用其他蛋白，仍需要更多的實驗去驗證。