曹彥強 王智慧 莫永亮 王 梅 蔣先軍?

（1 西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400715）（2 土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學院南京土壤研究所），南京 210008）

硝化作用長期以來被認為是一個兩步的過程，首先由氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）將氨氧化為亞硝酸鹽，再由亞硝酸鹽氧化細菌（Nitrite-oxidizing bacteria, NOB）將其氧化為硝酸鹽，從而完成整個硝化過程。但根據代謝過程中的動力學理論，由一種微生物來完成氨的兩步氧化過程是可行的［1］。2015年底，科學家在水生生態(tài)系統中發(fā)現了全程氨氧化微生物（Complete ammonia oxidizers，Comammox），能夠直接完成從氨氮到硝氮的氧化，其系統發(fā)育分類地位可歸屬于經典的NOB中的硝化螺菌屬（Nitrospira）［2-3］。通過比對已經發(fā)表和尚未發(fā)表的海量宏基因組數據庫以及最新的分子生態(tài)學研究，發(fā)現Comammox廣泛分布于土壤、淡水生態(tài)系統、污水和飲用水處理系統中［2-5］。但是，Comammox如何適應復雜環(huán)境并與傳統的AOA和AOB相互競爭共存，目前仍不清楚，是現在研究的熱點和難點。

氨氧化過程是在O2存在的條件下，微生物將NH3氧化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程。因此，環(huán)境中NH3和O2濃度的變化極有可能是驅動Comammox和AOA及AOB的關鍵環(huán)境因子。例如，土壤酸堿度是影響氨氧化微生物生態(tài)位分異的重要因素，其主要原因是H+介導的化學平衡使得酸性土壤中NH3濃度通常在nmol·L-1水平，中性和堿性土壤中在μmol·L-1水平［6］，同時，AOA對NH3的親和力遠高于AOB［7］。因此，AOA通常主導酸性土壤氨氧化［8］，而AOB則在中性和堿性土壤中發(fā)揮作用［9-10］。也有研究發(fā)現，AOA能夠更好地適應低O2脅迫，從而在水稻土氨氧化過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。最新的研究則表明，全程氨氧化細菌Nitrospira inopinata對底物NH3的親和力遠高于大多數可培養(yǎng)的AOA物種，能夠更好地適應極低NH3濃度的脅迫環(huán)境［13］。然而，在復雜土壤環(huán)境中，Comammox對O2和NH4+-N的環(huán)境適應機制仍鮮有報道。

稻田淹水導致其O2濃度遠低于旱地土壤，而施肥則可能提升NH3濃度刺激氨氧化微生物的生長。據此，本研究依托西南大學1989年設置的中性紫色水稻土長期定位試驗站，針對植稻淹水（夏季植稻施肥、全年淹水）和休耕冬干（不植稻、不施肥，僅在夏季植稻期間淹水，冬季排水落干）兩種不同處理下的水稻土，研究施肥和水分管理對水稻土硝化潛勢及氨氧化微生物豐度的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于國家紫色土長期定位試驗基地（106°26′E，30°26′N），地處重慶市北碚區(qū)，屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫18.30 ℃，年均降雨量1 105 mm，年均日照時數1 277 h，年均無霜期334 d。土壤類型為中性紫色水稻土。

1.2 研究方法

長期定位試驗始于1 9 8 9 年，設植稻淹水（PF）和休耕冬干（FD）兩種種植模式。植稻淹水處理夏季植稻、全年淹水。夏季按照傳統方法翻耕田地后種植水稻，施肥量為尿素273.1 kg·hm-2；過磷酸鈣500.3 kg·hm-2；氯化鉀150.1 kg·hm-2；過磷酸鈣作為底肥一次施用， 尿素2/3做底肥，1/3做追肥，氯化鉀底肥和追肥各1/2。休耕冬干處理全年不種植任何作物，夏季的水分管理與種植水稻相同，4月灌水，8月排水，但不施肥、不耕作、不種植，后期做進一步排水處理，全年約7個月處于落干狀態(tài)。

于2017年11月4日在兩種種植模式地塊分別采集表層(0～5 cm)土壤。采集后立即進行氨氧化微生物豐度的測定，部分土樣風干后測定其基本理化性質。

1.3 硝化潛勢的測定

硝化潛勢的測定采用好氣培養(yǎng)法［14］，稍作修改：稱取 15 g 鮮土置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4調節(jié)-N濃度至0.4 g·kg-1（干土質量計）。將三角瓶置于搖床，室溫25 ℃振蕩24 h。在第2、4、22、24小時分別取10 mL的振蕩懸濁液，以2液 m中ol·L-1KC的l含溶量液。浸以提培過養(yǎng)濾時間流動為分橫析坐儀標測，定懸濁含量為縱坐標，求出斜率，即土壤硝化潛勢。

1.4 DNA的提取

采用 F a s t D N A? S P I N K i t f o r S o i l(M P Biomedicals)試劑盒提取土壤基因組總DNA，稱取0.5 g土壤樣品，按試劑盒提供的操作步驟進行，將提取的 DNA 保存于-20 ℃用于后續(xù)分析。

1.5 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量PCR法在QuantStudioTM6 Flex定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific，Singapore)上測定AOA、AOB及Comammox分支A（Clade A）和分支B（Clade B）amoA基因的拷貝數。實時熒光定量PCR 所用的擴增引物如表1所示。AOA、AOB、Comammox Clade A、Comammox Clade B的amoA基因定量PCR所用反應體系均為20 μL，主要包含：待擴增的模板DNA1 μL、上下引物及ROX染料各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶10 μL、滅菌水7.8 μL。通過液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)含有目的基因的克隆子，按試劑盒(MiniBEST Plasmid Purification Kit)說明書方法提取、純化質粒后，在NanoDrop?ND-1000 UV-Vis分光光度計上測定質粒的濃度，并計算出目的基因的拷貝數。最后用TE緩沖溶液將質粒連續(xù)稀釋6～8個梯度以制作定量PCR的標準曲線。AOA、AOB的實時熒光定量PCR 擴增程序皆為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)。Comammox Clade A、Clade B的實時熒光定量PCR擴增程序皆為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，45個循環(huán)。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物Table 1 Real-time PCR Primers used in the study

1.6 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 13等軟件對數據進行處理分析。利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結 果

2.1 長期不同施肥和淹水管理對水稻土理化性質及硝化潛勢的影響

植稻淹水及休耕冬干兩種不同模式下水稻土的基本性質如表2所示。長期植稻淹水管理下水稻土的含水量為102.59%，遠高于對照處理的34.07%（休耕冬干）。植稻淹水和休耕冬干水稻土中銨態(tài)氮含量分別為17.77、4.09 mg·kg-1；硝態(tài)氮的含量分別為13.86、4.71 mg·kg-1；全氮含量分別為1.76、0.92 g·kg-1。休耕冬干水稻土有機質含量顯著高于植稻淹水處理，分別為20.51、17.55 g·kg-1。長期施肥顯著刺激了水稻土的硝化潛勢，植稻淹水和休耕冬干水稻土分別為25.0、2.11 mg·kg-1·d-1，兩者相差高達12倍。

表2 不同管理模式下水稻土的基本理化性質Table 2 Basic physico-chemical properties of the paddy soils relative to treatment

2.2 長期不同施肥和淹水管理對水稻土氨氧化微

生物豐度的影響

植稻淹水及休耕冬干這兩種水稻土中氨氧化微生物的豐度如圖1所示。長期施肥和淹水管理顯著影響了氨氧化微生物類群的豐度。相比于休耕冬干管理，植稻淹水刺激了Comammox Clade A、AOA和AOB的生長，三者增長倍數分別為9倍、3倍、42倍。兩種水稻土中，Comammox的豐度均高于AOA和AOB。植稻淹水中Comammox豐度分別是AOA的8.5倍、AOB的77.3倍，而休耕冬干中Comammox豐度分別是AOA的4.1倍、AOB的490.3倍。

如圖1所示，植稻淹水中Comammox Clade A的豐度高于休耕冬干水稻土，而Clade B的豐度卻低于休耕冬干，但兩種水稻土中，Comammox Clade A 的豐度均要高于Clade B。植稻淹水中Comammox Clade A和Clade B的amoA基因的拷貝數（以干土計，下同）分別為1.3 0×1 08copies·g-1、2.39×106copies·g-1；而休耕冬干中Comammox Clade A和Clade B的amoA基因的拷貝數分別為1.50×107copies·g-1、6.71×106copies·g-1（圖1a，圖1b）。

由圖1c、圖1d可知，植稻淹水中AOA的amoA基因拷貝數為1.57×107copies·g-1，遠高于休耕冬干水稻土的5.28×106copies·g-1。AOB的amoA基因拷貝數為 1.88×106copies·g-1，也高于休耕冬干。這兩種水稻土中AOA的豐度均高于AOB。

圖1 不同管理模式下水稻土中氨氧化微生物的豐度Fig.1 Abundance of the ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils relative to treatment

3 討 論

水稻土是我國重要的農業(yè)土地資源，約占全國耕地面積的1/5。本研究中，與休耕冬干相比，2 8 年長期植稻淹水管理極可能導致水稻土生態(tài)位發(fā)生顯著變化，進而影響氨氧微生物的生理生態(tài)功能。長期的施肥和植稻管理，顯著促進了水稻土的硝化潛勢，使其增幅高達12倍之多。實時熒光定量PCR分析表明，兩種水稻土均能檢測到Comammox、AOA和AOB，并且其數量均為Comammox＞AOA＞AOB。盡管Comammox豐度高并不意味著其在水稻土硝化過程中發(fā)揮重要作用，但其功能意義卻將是未來研究的重點。例如，植稻淹水條件下，大量施肥導致銨態(tài)氮濃度顯著高于休耕冬干，極高的水分含量也可能導致氧氣濃度顯著低于后者。植稻淹水土壤中，高氨低氧則可能刺激了Comammox Clade A的生長，而非Clade B，導致兩者的比值高達54.1，遠遠高于休耕冬干水稻土中的比值2.2（表3）。事實上，已有研究針對旱地土壤僅檢測到Comammox Clade B，而未發(fā)現Clade A［18］。這些結果也許暗示著Comammox Clade A更適應低氧的淹水環(huán)境，而Clade B可能在高氧的旱地土壤中具有生理活性。

表3 不同管理模式下水稻土中氨氧化微生物的數量比Table 3 Ratio of ammonia-oxidizing microorganisms in paddy soils relative to treatment

施肥通常能夠增加土壤銨態(tài)氮濃度并刺激土壤硝化活性。植稻淹水中銨態(tài)氮的濃度達到了17.77 mg·kg-1，是休耕冬干水稻土的4倍多。底物濃度對氨氧化微生物的相對豐度和分布起著重要的作用，新發(fā)現的Comammox被證實能夠更好地適應于極低氨濃度的環(huán)境。本研究在休耕冬干水稻土中檢測到的Comammox Clade B的amoA基因的拷貝數也確實要高于底物濃度較高的植稻淹水水稻土。相比于植稻淹水，休耕冬干水稻土每年4—8月淹水，隨后處于落干狀態(tài)。土壤水分也是影響硝化微生物活性的重要因素，通過控制空氣中O2的擴散而間接影響好氧微生物的活性。目前已知的所有氨氧化微生物皆為好氧生長類型，也有研究指出AOA和AOB對水分條件和氧氣的要求不同［19-20］，但Comammox對氧氣脅迫的適應機制尚不清楚。盡管無法區(qū)分施肥和淹水管理對氨氧化微生物功能的相對影響，但全年淹水的植稻水稻土中Comammox Clade A更高，表明其能更好適應氧氣脅迫，并可能具有更為廣泛的底物適應范圍。

盡管植稻淹水和休耕冬干水稻土中A O A 和AOB數量均顯著低于Comammox，但數量上的優(yōu)勢并不一定具有功能意義，目前的研究并不能排除AOA和AOB在硝化過程中發(fā)揮了重要作用。事實上已有的研究表明不同母質水稻土中，AOA和AOB對硝化作用的相對貢獻明顯不同［12］。此外，本研究表明與AOB相比，AOA適應低氨脅迫的能力更強。例如，盡管植稻淹水中AOA和AOB的豐度均要高于休耕冬干水稻土，但在休耕冬干水稻土中，兩者豐度的比值卻高達118.3，遠高于植稻淹水中的9.2，說明在銨態(tài)氮濃度較低的休耕冬干水稻土中，AOA較之AOB具有更強的競爭優(yōu)勢（表3）。這些結果與已有的報道一致，在土壤生態(tài)系統中較低的銨態(tài)氮濃度下能夠觀察到更高的AOA∶AOB的比值［21］。

農業(yè)種植模式、化肥施用、灌溉管理以及土壤類型等均會對微生物數量、活性與種群結構產生較大影響［22-25］。而硝化作用是農田氮循環(huán)的關鍵過程，其發(fā)生與速率主要受氨氧化微生物的豐度和活性制約。Comammox的發(fā)現表明在農田土壤硝化過程仍有大量亟待解決的科學問題。首先，由于氨被完全氧化成硝酸鹽可以釋放出更高的能量，那么在什么情況下Comammox對硝化作用的貢獻會超過別的硝化微生物？以往對Comammox的忽視是否導致過高估計了傳統硝化微生物的功能？此外，尤為重要的是要了解Comammox與傳統氨氧化微生物（AOA和AOB）的生態(tài)位劃分及其功能意義。例如，以往穩(wěn)定性同位素示蹤氨氧化微生物DNA試驗中，發(fā)現Nitrospira中類群在13C-DNA中的豐度遠高于AOA和AOB［12］，但這些微生物是否為Comammox并在土壤氨氧化過程中發(fā)揮了重要作用，仍待進一步研究。

4 結 論

在植稻淹水和休耕冬干水稻土中都檢測到了較高豐度的Comammox，表明Comammox廣泛分布于水稻土壤中，并有可能在水稻土的硝化過程中發(fā)揮重要作用。此外，水稻土中Comammox Clade A的豐度要高于Clade B，長期的施肥和淹水管理會對水稻土中Comammox的兩個分支的豐度產生一定影響。施肥種植可能刺激了Comammox Clade A、AOA和AOB的生長。