劉岳飛 吳人敏 張傳進(jìn) 姚華開(kāi) 楊尚東，2?

（1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004）（2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

廣西是我國(guó)最大的秋冬蔬菜生產(chǎn)基地，其中辣椒的種植面積最大［1］。隨著人民生活水平及對(duì)蔬菜品質(zhì)要求的提高，辣椒生產(chǎn)中運(yùn)用地膜越來(lái)越廣泛。覆蓋地膜不僅具有促進(jìn)水土保持與防治雜草滋生等作用，也有利于提高土壤溫度、促進(jìn)土壤微生物對(duì)有機(jī)殘?bào)w的分解，提高土壤有效養(yǎng)分含量［2］，而且能保水保墑、抑制雜草、改善土壤結(jié)構(gòu)［3］和提高土壤肥力，降低生產(chǎn)成本［4-5］。盡管地膜在調(diào)節(jié)地溫方面發(fā)揮著重要作用，但長(zhǎng)期覆蓋地膜在提高土壤溫度的同時(shí)往往也會(huì)加速土壤有機(jī)質(zhì)降解，從而導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量下降，進(jìn)而影響土壤肥力和生態(tài)系統(tǒng)功能［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，覆蓋地膜調(diào)控土壤溫度主要取決于薄膜對(duì)光的透過(guò)率和反射率，即：很大程度上取決于薄膜的顏色：無(wú)色透明膜對(duì)促進(jìn)地溫升高效果最好，但容易滋生雜草；黑色地膜雖然能有效防止雜草，但升溫效果不及透明膜［8］。這些結(jié)果表明，不同地膜的作用效果不同，而實(shí)際生產(chǎn)中如果盲目地使用地膜，長(zhǎng)期連續(xù)或全程覆膜將有可能惡化土壤生態(tài)條件，導(dǎo)致土壤肥力下降［9］。近年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)覆蓋地膜影響辣椒生長(zhǎng)、產(chǎn)量的研究較多，但大多數(shù)研究聚焦于地上部生理指標(biāo)以及根系分泌物，而且涉及地膜的應(yīng)用研究多集中在北方寒冷地區(qū)。目前，我國(guó)南方地區(qū)地膜使用量和地膜覆蓋面積呈逐年增加的趨勢(shì)［10］，雖然地膜對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)及土壤理化性質(zhì)、水分利用效率等方面至今已有較多的研究［11］，但應(yīng)用不同地膜對(duì)土壤微生物多樣性的影響研究多集中于我國(guó)北方地區(qū)［12-13］。南方地區(qū)應(yīng)用地膜對(duì)土壤微生物多樣性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本文研究覆蓋不同種類(lèi)地膜對(duì)我國(guó)南方植椒土壤溫度、理化性狀及生物學(xué)特性的影響，旨在評(píng)價(jià)覆蓋地膜對(duì)植椒土壤肥力與健康狀況的影響，為我國(guó)南方地區(qū)科學(xué)利用地膜提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2016年在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地（東經(jīng)108°18′，北緯22°51′）進(jìn)行，辣椒品種為“桂椒8號(hào)”，于2月下旬育苗，4月中旬定植。試驗(yàn)地土壤類(lèi)型為赤紅壤，試驗(yàn)前土壤pH6.08, 有機(jī)質(zhì)含量7.30 g·kg-1，全氮0.82 g·kg-1，全磷0.51 g·kg-1，全鉀14.57 g·kg-1，堿解氮57.60 mg·kg-1，有效磷3.22 mg·kg-1，速效鉀82.94 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)五個(gè)處理：不覆膜對(duì)照（M1）和覆蓋黑色聚乙烯地膜（黑色地膜，M2）、無(wú)色透明聚乙烯地膜（無(wú)色透明地膜，M3）、銀色聚乙烯地膜（銀色地膜，M4）、麻類(lèi)材料地膜（M5），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列。每個(gè)小區(qū)面積30 m2，株距30 cm×30 cm。辣椒定植后，施肥等日常管理按常規(guī)方法統(tǒng)一進(jìn)行。

在辣椒采收期間（8月25日）按“S”型采集耕作層（0～30 cm）土壤樣品。每個(gè)小區(qū)分別采集5～8個(gè)點(diǎn)，去除殘根等雜物后充分混勻，并用無(wú)菌塑料袋裝好帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分室內(nèi)自然風(fēng)干后過(guò)40目篩，用于土壤理化性狀測(cè)定；另一部分過(guò)10目篩后，置于4℃冰箱保存，用于土壤生物學(xué)性狀分析（其中用于高通量測(cè)序分析的樣品在采集后按測(cè)序樣品要求即時(shí)處理并包裝送檢）。

2016年6月1日至8月25日每天早上10:00，采用WQG-16曲管地溫表讀取不同深度（5、10、15、20 cm）土壤溫度。土壤含水量、pH和有機(jī)質(zhì)分別采用稱(chēng)重法、PHS-3C型精密酸度計(jì)和重鉻酸鉀容量法測(cè)定。

土壤微生物生物量碳、氮和磷測(cè)定采用氯仿熏蒸提取-容量分析法［14］、茚三酮比色法［15］和磷鉬藍(lán)比色法［16］。土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性測(cè)定采用Hayano［17］、Ladd［18］及Tabatabai和Bremner［19］的方法。

1.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

總DNA提取與PCR擴(kuò)增：采用 OMEGA 土壤提取試劑盒提取總 D N A，用 Q u b i t 2.0 檢測(cè) D N A 濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè) D N A 完整性。每個(gè)樣品 3次重復(fù)，將同一樣品的DNA 混合，作為每份土壤樣品的總 D N A。P C R 擴(kuò)增采用的是1 6 S r R N A 基因中V 3-V 4 高變區(qū)通用引物3 4 1 F(C C TA C G G G N G G C W G C A)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。擴(kuò)增條件設(shè)置：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30s，45℃退火20 s，65 ℃延伸30s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃延伸20 s，55℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)。進(jìn)一步采用匹配Illumina測(cè)序接頭和標(biāo)簽引物擴(kuò)增，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat:SK8131）對(duì)DNA 進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物用 Qubit2.0定量，根據(jù)測(cè)得的 DNA 濃度將所有樣品按照1∶1 的比例進(jìn)行混合，用于后續(xù)測(cè)序。

高通量測(cè)序：16S rRNA 基因的 PCR 產(chǎn)物由北京百邁客生物科技有限公司完成測(cè)序，測(cè)序儀器為Illumina公司的新一代測(cè)序儀Hiseq 2500，測(cè)序所得結(jié)果，采用prinseq軟件對(duì)reads1、reads2的3端進(jìn)行質(zhì)控，截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)序列融合比率。通過(guò) Flash 軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列。采用prinseq軟件對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行計(jì)算處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗(yàn)采用鄧肯（Duncan）法，不同字母表示在P＜0.05水平具有顯著性差異。使用R語(yǔ)言工具進(jìn)行微生物多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及繪制樣品各分類(lèi)水平下的群落結(jié)構(gòu)柱形圖和維恩圖。

2 結(jié) 果

2.1 覆蓋地膜對(duì)土壤溫度、含水量和pH的影響

表1所示土壤溫度為試驗(yàn)地夏季（6、7、8月份）每天上午10:00地溫的觀測(cè)平均值。由表1可知，隨著土壤深度的增加，覆蓋地膜土壤溫度均呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢(shì)，這與外界光照強(qiáng)度以及地膜的保溫作用有關(guān)。其中，覆蓋具有良好透水、透氣效果的麻類(lèi)材料（M5），土壤溫度和對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而覆蓋透水、透氣性差的聚乙烯類(lèi)地膜，土壤溫度則顯著升高。覆蓋無(wú)色透明地膜，不同深度地溫均顯著高于對(duì)照，且在四種地膜中保溫效果最好；覆蓋黑色地膜對(duì)不同深度土壤溫度的提升效果顯著高于銀色地膜、麻類(lèi)材料。

表1 覆蓋不同種類(lèi)地膜對(duì)植椒土壤溫度、含水量和pH的影響Table 1 Effects of mulching on soil temperature, water content, and pH in pepper fields relative to type of the mulching film

與對(duì)照相比，覆蓋除麻類(lèi)材料外的地膜均顯著提高了植椒土壤的含水量，并顯著提高了土壤pH，即聚乙烯類(lèi)材料地膜更有助于保持土壤水分含量和減緩?fù)寥纏H下降。

2.2 覆蓋地膜對(duì)土壤微生物生物量及酶活性的影響

由表2可知，與對(duì)照相比，覆蓋不同種類(lèi)地膜不同程度地提高了植椒土壤的微生物碳、氮、磷。其中，覆蓋不同種類(lèi)地膜均顯著提高了土壤微生物生物量碳，覆蓋無(wú)色透明地膜和麻類(lèi)材料地膜均顯著提高土壤微生物生物量氮，覆蓋除麻類(lèi)材料外的地膜均顯著提高了土壤微生物生物量磷。與此同時(shí)，覆蓋除麻類(lèi)材料外的地膜均顯著提高了植椒土壤的β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性，提升效果最佳的為無(wú)色透明地膜。覆蓋地膜條件下土壤酶活性的變化與土壤溫度的變化趨勢(shì)相似。

2.3 覆蓋地膜對(duì)土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的影響

測(cè)序共獲得有效序列348 687條，平均長(zhǎng)度為422 bp，測(cè)序覆蓋率在 82.4%～84.8%。根據(jù)分類(lèi)學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同分組（或樣本）在屬分類(lèi)水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況（圖1）。未可培養(yǎng)細(xì)菌在所有土壤樣品均占據(jù)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度最高的為M1（達(dá)53.78%）、最低的為M2（黑色地膜，為40.57%），表明覆膜降低了未可培養(yǎng)細(xì)菌的相對(duì)豐度?？设b別的優(yōu)勢(shì)菌屬依次為黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。其中，覆膜土壤黃桿菌屬的相對(duì)豐度顯著大于CK，且M4（銀色地膜）處理最高。M4處理土壤pH顯著高于其他處理（表1），而且覆蓋黑色和無(wú)色透明地膜處理土壤的pH亦顯著高于CK，推測(cè)土壤酸化可能不利于黃桿菌屬細(xì)菌的生存。姜英華等［20］研究發(fā)現(xiàn)溶桿菌對(duì)真菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和線(xiàn)蟲(chóng)都有突出的拮抗作用。覆膜處理（M3除外）土壤中溶桿菌屬的相對(duì)豐度均顯著高于CK，其中M2處理最高，表明遮光環(huán)境或更有利于溶桿菌的生長(zhǎng)。芽胞桿菌是一類(lèi)常見(jiàn)的根際促生細(xì)菌，其對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和減少病害發(fā)生有積極作用［21］。覆膜處理中M5（麻類(lèi)材料地膜）處理的芽胞桿菌相對(duì)含量最高，表明遮光與透氣的地膜有助于土壤中芽胞桿菌的生存與繁衍。此外，產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）、鞘氨醇單胞菌屬、硝化螺菌屬（Nitrospira）、產(chǎn)堿桿菌屬、粘細(xì)菌屬（Haliangium）、蘚桿菌屬（Bryobacter）等在覆膜條件下均發(fā)生了一定程度的變化，但變化幅度小于黃桿菌屬和溶桿菌屬。

表2 覆蓋不同種類(lèi)地膜對(duì)植椒土壤微生物生物量及酶活性的影響Table 2 Effects of mulching on soil microbial biomass and enzyme activities in pepper fields relative to type of the mulching film

圖1 土壤細(xì)菌屬分類(lèi)水平的組成和相對(duì)豐度（a）及在OTU水平的維恩圖（b）Fig. 1 Composition and relative abundance of the soil bacteria at genus level (a) and Venn diagram of the soil bacteria at OTU level (b)

維恩圖可以反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況，由圖1b可知，不同處理土壤樣品的共有OTU值為1 778，占各樣品總OTU的84.4%～88.1%。其中，M1所含的獨(dú)立OTU數(shù)值最大為6，占該樣品總OTU的0.29%；而其他樣品所含獨(dú)立OTU值分別為（2、0、2、1），占各樣品總OTU的0%～0.10%，均小于對(duì)照（M1）。究其原因，可能是CK直接與空氣接觸從而產(chǎn)生土壤細(xì)菌與外界環(huán)境細(xì)菌之間的相互交換以及黏附于空氣塵埃細(xì)菌的沉降有關(guān)；而其他處理由于地膜的物理阻隔作用使覆蓋地膜區(qū)土壤微環(huán)境相對(duì)封閉。

微生物群落多樣性特征分析中，C h a o 1、ACE、香農(nóng)指數(shù)越大，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高［22］；由表3可知，Chao1 指數(shù)與香農(nóng)指數(shù)由高到低依次為無(wú)色透明地膜、麻類(lèi)材料地膜、銀色地膜、黑色地膜、CK；ACE指數(shù)由高到低的順序?yàn)闊o(wú)色透明地膜、銀色地膜、CK、麻類(lèi)材料地膜、黑色地膜，表明除覆蓋黑色地膜和麻類(lèi)材料地膜會(huì)使土壤細(xì)菌群落中某些細(xì)菌種群繁殖較好、在群落中優(yōu)勢(shì)度上升而導(dǎo)致ACE指數(shù)下降外，覆蓋銀色和無(wú)色透明地膜并沒(méi)有導(dǎo)致土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)ACE下降。

3 討 論

地膜具有調(diào)節(jié)土溫、保持水土、維持土壤結(jié)構(gòu)、防治雜草與病毒病以及防止土壤鹽類(lèi)積累等作用，而且黑色和銀色地膜提高土溫效果不及透明地膜［8］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)應(yīng)用地膜，其調(diào)節(jié)土溫的效果與上述的研究結(jié)果相一致，即：無(wú)色透明地膜提升土溫的效果最為顯著；表明透氣透水性差的聚乙烯類(lèi)地膜均有助于提升土壤溫度，但覆蓋材料的透光性能亦是左右土壤溫度的一個(gè)重要因素。另一方面，聚乙烯類(lèi)材料地膜覆蓋顯著地減緩了土壤pH的下降，原因可能是聚乙烯類(lèi)材料地膜透水性能不佳，從而減少了雨水或灌溉水對(duì)土壤鹽基陽(yáng)離子的淋溶，從而減緩了土壤pH的下降。由此推斷，在南方植椒土壤中應(yīng)用不同地膜（尤其是聚乙烯材料地膜）不僅有助于提高土壤溫度與含水量，而且對(duì)減緩?fù)寥纏H下降亦具有顯著效果。

表3 覆蓋不同種類(lèi)地膜對(duì)植椒土壤細(xì)菌多樣性的影響Table 3 Effect of mulching on soil bacterial diversity in pepper fields relative to type of the mulching film

土壤微生物活性與多樣性的變化能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況［23］。其中，土壤酶參與土壤中幾乎所有的有機(jī)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)［24］，其活性大小不僅能指示土壤生態(tài)系統(tǒng)功能變化的多樣性和穩(wěn)定性［25］，亦是評(píng)價(jià)土壤健康和肥力水平的重要指標(biāo)［26］。本試驗(yàn)中，覆蓋聚乙烯材料地膜均顯著提高植椒土壤中β-葡糖苷酶、磷酸酶和氨肽酶活性，這一現(xiàn)象可能與地膜覆蓋處理提高了土壤溫度、土壤含水量以及細(xì)菌數(shù)量緊密相關(guān)。土壤微生物生物量同樣是衡量土壤質(zhì)量、維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力的一個(gè)重要指標(biāo)［27］。與對(duì)照相比，覆蓋地膜均不同程度地提高了植椒土壤中的微生物生物量碳、氮、磷，表明南方地區(qū)當(dāng)前應(yīng)用地膜的模式不僅沒(méi)有導(dǎo)致土壤質(zhì)量劣化，而且還有助于維護(hù)植椒土壤肥力。

基于高通量測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，覆蓋不同地膜還有利于提高植椒土壤細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)，尤其以無(wú)色透明地膜的提升效果尤為顯著，其原因可能與無(wú)色透明地膜顯著提高土壤溫度、含水量和減緩?fù)寥纏H下降的作用緊密相關(guān)。根據(jù)位于北方地區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，地膜覆蓋顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，其影響效果主要通過(guò)對(duì)土壤有機(jī)碳、總氮、有效磷、pH以及土壤水分的間接作用實(shí)現(xiàn)的［13］。本試驗(yàn)中，南方地區(qū)應(yīng)用地膜覆蓋，同樣不同程度地具有影響土壤微生物豐富度和多樣性的作用效果，尤其是無(wú)色透明地膜，呈現(xiàn)影響土壤微生物豐富度和多樣性的顯著效果。其原因可能與無(wú)色透明地膜顯著提高了土壤溫度，水分含量以及減緩?fù)寥纏H的下降緊密相關(guān)。另一方面，表明我國(guó)南、北方地區(qū)應(yīng)用地膜對(duì)土壤微生物多樣性的影響具有相似的作用效果。此外，屬分類(lèi)水平上，黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽胞桿菌屬和未可培養(yǎng)細(xì)菌屬細(xì)菌均為南方地區(qū)覆蓋地膜植椒土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。已有的研究證實(shí)，溶桿菌屬的大多數(shù)細(xì)菌對(duì)病原真菌、G＋細(xì)菌、線(xiàn)蟲(chóng)和綠藻均有突出的拮抗作用［28］；芽胞桿菌屬細(xì)菌對(duì)促進(jìn)誘導(dǎo)作物系統(tǒng)抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)有積極作用［29］；鞘氨醇單胞菌屬的細(xì)菌對(duì)于土壤中多環(huán)芳烴的降解起到一定的調(diào)控作用［30］；產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌（H16）參與土壤中氫化酶的合成調(diào)節(jié)，對(duì)土壤氫循環(huán)起到重要的作用［31］。

雖然在97%相似度的聚類(lèi)分析還未能完全查明土壤細(xì)菌遺傳多樣性，但是基于高通量測(cè)序深度基本能夠反映該區(qū)域細(xì)菌群落的種類(lèi)和結(jié)構(gòu)，完全可以定量比較整個(gè)群落組成和多樣性的相對(duì)差異［32］。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，南方地區(qū)當(dāng)前辣椒實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)用不同地膜，尤其覆蓋以聚乙烯為原料的黑色、銀色或無(wú)色透明地膜不僅有助于提高土壤溫度和保持水土、減緩?fù)寥浪峄M(jìn)程，維護(hù)土壤肥力，提高植椒土壤中細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)，而且還助于形成以溶桿菌屬、芽胞桿菌屬細(xì)菌等為優(yōu)勢(shì)菌屬的土壤環(huán)境，這些具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，維護(hù)土壤健康作用的優(yōu)勢(shì)菌屬將有利于生態(tài)防控植椒菜園土傳病害的發(fā)生與蔓延。

4 結(jié) 論

當(dāng)前南方地區(qū)辣椒實(shí)際生產(chǎn)中，覆蓋不同種類(lèi)地膜（尤其以聚乙烯為原料的無(wú)色透明地膜、黑色地膜和銀色地膜）不僅有助于提高辣椒菜園耕

作層土壤溫度與含水量，而且對(duì)減緩南方地區(qū)植椒土壤pH的下降、提高土壤微生物生物量以及酶活性具有顯著的效果。同時(shí)，應(yīng)用地膜還有助于提高植椒土壤中細(xì)菌的豐富度（Chao1）和多樣性（Shannon）指數(shù)。另一方面，黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽胞桿菌屬細(xì)菌等一些具有生防作用的益生細(xì)菌是覆蓋地膜植椒土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬，表明當(dāng)前南方地區(qū)辣椒生產(chǎn)中應(yīng)用地膜不僅沒(méi)有導(dǎo)致植椒土壤質(zhì)量劣化，而且還有助于提高土壤肥力和保持土壤健康。