鄧 潔，羅劍波，彭 聰，鄧曉楊

腫瘤是一種基因病，同時(shí)也是一種代謝性病[1-3]。大量研究表明，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了顯著的改變，主要體現(xiàn)為：糖酵解與脂肪酸從頭合成活性的顯著增強(qiáng)，以及谷氨酰胺代謝異?；钴S[4]。靶向異常改變的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是良好的腫瘤靶向治療策略[5-7]。目前，與糖酵解和谷氨酰胺代謝相比，腫瘤細(xì)胞的脂肪酸代謝異常受到的關(guān)注相對(duì)較少[8]。而事實(shí)上，腫瘤細(xì)胞的快速分裂增殖需要大量的脂肪酸為其生物膜等結(jié)構(gòu)性成份的合成提供原料[9]，脂肪酸代謝重編程已被證實(shí)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[10-11]。

乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylas 1,ACC1)是參與脂肪酸合成調(diào)控第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A。近年來(lái)，ACC1被證實(shí)在多種類型的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常升高，其中包括肝癌、肺癌、乳腺癌與胰腺癌等[12-15]，以ACC1為靶點(diǎn)的抑制劑被證實(shí)可通過(guò)抑制脂肪酸合成而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[16-17]。然而，卵巢癌細(xì)胞中ACC1的表達(dá)與作用尚不十分清楚。本研究旨在探討ACC1在卵巢癌組織中的表達(dá)及其在卵巢癌細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌細(xì)胞系與組織標(biāo)本

1.1.1 卵巢癌細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞系SKOV3購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清(SV30087，Hyclone，美國(guó))的RPMI-1640培養(yǎng)基(R8758，Sigma-Aldrich，美國(guó))，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)為37 ℃含5%濃度的CO2。

1.1.2 臨床組織標(biāo)本 共收集10例卵巢癌患者癌與癌旁組織，所有患者具有完整臨床資料與明確的病理診斷，并事先簽署了知情同意書(shū)，術(shù)中取得組織后立即置于液氮中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 首先，用組織RNA提取試劑盒(R6688，美國(guó)OMEGA公司)對(duì)卵巢癌組織與癌旁組織中總RNA進(jìn)行提取。隨后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，日本TAKARA公司)將所提RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需分別合成目的基因ACC1與內(nèi)參基因GAPDH的引物，ACC1引物序列為：上游5′-ATGTCTGGCTTGCACCTAGTA-3′，下游5′-CCCCAAAGCGAGTAACAAATTCT-3′；GAPDH序列為：上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；用2-△△Ct相對(duì)定量法對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 Western Blot 首先，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液對(duì)卵巢癌癌組織與癌旁組織進(jìn)行裂解以提取總蛋白，并采用BAC法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。隨后加入商品化的蛋白上樣緩沖液并在沸水中煮5 min，按BCA定量結(jié)果將相同量的蛋白上樣至聚丙烯酰胺凝膠孔中后即可進(jìn)行電泳分離，待酚藍(lán)至凝膠底部時(shí)即可停止電泳。隨后將凝膠中蛋白用“三明治”法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜表面。膜用5%的BSA溶液室溫封閉1 h后，加入稀釋過(guò)的ACC1抗體(1∶1 000)并于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次(每次5 min)后加入二抗并于28 ℃孵育2 h，繼續(xù)用PBS洗滌3次(每次5 min)。最后，用ECL發(fā)光系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 siRNA下調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ACC1表達(dá)首先由上海吉瑪公司合成兩條靶向ACC1不同區(qū)域的siRNA干涉片段，靶向序列分別為：siACC1#1為CCUACAAUGGGAACAGCUA;siACC1#2為GAACUUAACCGGAUGCGUA。隨后，將合成好的siRNA轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，方法為：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度種至6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按脂質(zhì)體(lipofectamine 2000，lip2000)操作說(shuō)明進(jìn)行。分別將lip2000與siRNA片段用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，靜止5 min后將二者混和并進(jìn)行上下顛倒混合，靜置25 min后用移液器吸取100 μL并加入6孔板細(xì)胞中，隨后將細(xì)胞置于孵箱中培養(yǎng)，6 h后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。此時(shí)，細(xì)胞即可分別用于四氮唑藍(lán)鹽[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium inner salt，MTS]增殖、5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EDU)與凋亡實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 MTS增殖實(shí)驗(yàn) 用“1.2.3”中所述的方法對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ACC1表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉處理，胰酶消化并離心收集細(xì)胞按3×103個(gè)/孔的密度接種至96孔板中。分別在第1、2、3、4、5天進(jìn)行MTS檢測(cè)，具體操作步驟如下：用移液器將10 μL的MTS工作液加入96孔板中并在37 ℃反應(yīng)4 h，隨后于450 nm處檢測(cè)吸光值(optical density，OD)。以時(shí)間(天)為橫軸，OD為縱軸繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.5 EDU實(shí)驗(yàn) 用“1.2.3”中所述的方法對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ACC1表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉處理，胰酶消化并離心收集細(xì)胞按5×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種至共聚焦顯微鏡專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜后即可進(jìn)行后續(xù)EDU染色實(shí)驗(yàn)，染色過(guò)程嚴(yán)格按EDU試劑說(shuō)明書(shū)(廣州銳博生物公司，貨號(hào)C10327-1)進(jìn)行，細(xì)胞依次經(jīng)Triton-X-100打孔、4%多聚甲醛固定后、EDU染色、細(xì)胞核復(fù)染后，用激光共聚焦顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。以時(shí)間(天)為橫軸，OD為縱軸繪制細(xì)胞的增殖曲線。

1.2.6 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 首先，用“1.2.3”中所述的方法對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中ACC1表達(dá)進(jìn)行siRNA干涉處理，胰酶消化并離心收集細(xì)胞，隨后按凋亡試劑盒說(shuō)明(美國(guó)Everbright lnc公司，貨號(hào)Y6026)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V與PI染色，最后上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者癌與癌旁組織中ACC1的表達(dá)情況 分別用qRT-PCR與Western Blot對(duì)10例卵巢癌患者癌組織與癌旁組織中ACC1的mRNA與蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖1A與1B所示：所有10例卵巢癌患者癌組織中ACC1表達(dá)均不同程度的高于癌旁組織(P<0.01)，表明ACC1在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生了顯著上調(diào)。

圖1 卵巢癌患者癌與癌旁組織中ACC1的表達(dá)

2.2 siRNA下調(diào)對(duì)SKOV3細(xì)胞中ACC1表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響 為研究ACC1在卵巢癌細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用，首先合成了2條靶向ACC1不同位置的siRNA干涉片段(分別命名為si-ACC1#1與si-ACC1#2)，通過(guò)用qRT-PCR與Western Blot分析二者干涉效率后發(fā)現(xiàn)(圖2A與2B)：轉(zhuǎn)染2條siRNA(si-ACC1#1與si-ACC1#2)均可顯著下調(diào)SKOV3細(xì)胞中ACC1的表達(dá)(P<0.01)，且二者效率相當(dāng)。

圖2 siRNA下調(diào)SKOV3細(xì)胞中ACC1表達(dá)的qRT-PCR與Western Blot驗(yàn)證

用MTS實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)ACC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的影響，結(jié)果表明下調(diào)ACC1表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的增殖被顯著抑制(P<0.01；圖3)。

圖3 MTS實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)ACC1對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

利用EDU實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)ACC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的影響，結(jié)果與MTS相一致，下調(diào)ACC1表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖被顯著抑制(P<0.01；圖4)。

圖4 EDU實(shí)驗(yàn)分析下調(diào)ACC1對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

2.3 siRNA下調(diào)對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響 進(jìn)一步又利用流式細(xì)胞術(shù)分析下調(diào)ACC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明下調(diào)ACC1表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡未發(fā)生顯著改變(P>0.05；圖5)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析下調(diào)ACC1對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

Cell雜志在2011發(fā)表權(quán)威綜述文章，總結(jié)了腫瘤細(xì)胞的十大最主要特征，其中包括了腫瘤細(xì)胞代謝的重編程[18]。腫瘤細(xì)胞代謝重編程的主要表現(xiàn)包括糖酵解、脂肪酸從頭合成和谷氨酰胺代謝的異常活躍[19]。而其中，與糖酵解和谷氨酰胺代謝相比，腫瘤細(xì)胞脂肪酸代謝受到的關(guān)注相對(duì)較少。但目前研究已證實(shí)，脂肪酸從頭合成增強(qiáng)是大多數(shù)類型腫瘤細(xì)胞所具有的共同代謝特點(diǎn)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用[17,20]。腫瘤細(xì)胞通過(guò)大量合成游離脂肪酸，為其快速分裂增殖所需的生物膜等結(jié)構(gòu)性成份的合成提供脂類原料[9]。此外，多種脂肪酸衍生物，如溶血磷脂酸[21-22]和人前列腺素[23]等，均是細(xì)胞內(nèi)重要的參與生存、增殖和轉(zhuǎn)移調(diào)控的信號(hào)分子[11]。

ACC1是調(diào)控脂肪酸合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A。近年來(lái)，多個(gè)研究證實(shí)，ACC1在肝癌、肺癌、乳腺癌與胰腺癌中表達(dá)均異常升高。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中ACC1表達(dá)顯著上調(diào)，ACC1可通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞中脂含量?jī)?chǔ)存，而促進(jìn)能量應(yīng)激時(shí)腫瘤細(xì)胞的生存。Svensson等[13]在肺癌中研究也證實(shí)，抑制ACC1可通過(guò)抑制脂肪酸合成而抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。Chajes等[14]在乳腺癌中研究也發(fā)現(xiàn)，用siRNA下調(diào)ACC1可降低細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量，并能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。同樣，Petrova等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ACC1在胰腺癌中顯著高表達(dá)，通過(guò)小分子抑制劑抑制ACC1活性后，腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的脂化與脂相關(guān)信號(hào)均被顯著抑制，并最終使腫瘤細(xì)胞的增殖變慢。此外，Corominas-Faja等[24]研究發(fā)現(xiàn)，用小分子化合物抑制ACC1活性后，乳腺癌干細(xì)胞的自我更新被顯著抑制。

以往研究表明，卵巢癌中脂類信號(hào)分子，尤其是溶血磷脂酸的水平顯著升高并調(diào)控腫瘤多個(gè)惡性生物學(xué)過(guò)程[25]，表明脂代謝異常與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而目前，卵巢癌組織細(xì)胞中ACC1等調(diào)控脂肪酸代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)與作用尚不十分清楚。本研究在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)：ACC1在卵巢癌中表達(dá)顯著上調(diào)；下調(diào)ACC1可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，而不影響其凋亡。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明卵巢癌細(xì)胞中脂肪酸合成活性異常增強(qiáng)，并提示通過(guò)靶向ACC1分子抑制脂肪酸合成可能是潛在的卵巢癌治療分子靶標(biāo)。但本研究尚缺乏ACC1對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)與凋亡調(diào)控作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。此外，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞中ACC1表達(dá)上調(diào)及ACC1調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。