田 甜， 梁 霞， 韓翠欣， 陳詠梅， 王曉丹， 班 玲， 劉永權(quán)

河北省石家莊市第二醫(yī)院產(chǎn)科，石家莊 050051

妊娠期高血壓病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是一種臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重的妊娠期并發(fā)癥，是造成孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因，但是目前對(duì)于其發(fā)病原因與發(fā)病機(jī)制至今尚無(wú)明確定論。近年來(lái)，子宮及胎盤(pán)缺血、缺氧在HDCP發(fā)病中的作用已得到普遍認(rèn)可[1-3]。相關(guān)研究[4-5]顯示：IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素在HDCP相關(guān)的病理及生理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。因此，觀察3種因子在不同嚴(yán)重程度HDCP患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)及相互作用，可以為HDCP的發(fā)病機(jī)制及臨床治療及預(yù)防提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入選2016年7月至2018年1月在石家莊市第二醫(yī)院和河北省二院住院分娩的HDCP患者。臨床診斷符合第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》中妊娠期高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)與分類(lèi)原則[6]。納入120例符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的為病例組，其中妊娠期高血壓48例，輕度子癇前期40例，重度子癇前期32例，對(duì)照組為同期分娩的50例正常妊娠婦女的胎盤(pán)組織。兩組研究對(duì)象均為單胎初產(chǎn)婦，既往無(wú)心臟病、肝腎疾病、糖尿病、高血壓等病史，無(wú)其他妊娠期合并癥、并發(fā)癥，均無(wú)吸煙史，均于臨產(chǎn)前接受剖腹產(chǎn)。其中病例組年齡20～35歲，平均(28.7±4.5)歲，妊娠周期35～40周，平均(37.5±2.3)周，孕期平均體質(zhì)量(52.4±22.3) kg，平均身高(160.3±8.3) cm，對(duì)照組年齡20～35歲，平均(28.5±4.6)歲，妊娠周期35～40周，平均(37.7±2.4)周，孕期平均體質(zhì)量(53.7±22.7) kg，平均身高(161.3±8.9) cm，兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人IGF-Ⅱ單克隆抗體、兔抗人IGFBP-1單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司；抵抗素兔抗人多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；粘合劑(APES)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和SP9000 通用型試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉和氯化鉀等化學(xué)試劑由北京益利化學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.3 樣本采集與處理 剖宮產(chǎn)娩出胎盤(pán)后從母面中央采集1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm胎盤(pán)組織，注意避開(kāi)出血壞死區(qū)與鈣化區(qū)，然后用生理鹽水沖洗干凈后置于10%甲醛固定液中24 h以上，固定組織樣本后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，取4 μm切片做免疫組化染色。

1.4 免疫組化染色 S-P法測(cè)定胎盤(pán)組織中IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)水平。將石蠟包埋切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理，并用梯度乙醇進(jìn)行水化處理，然后進(jìn)行抗原熱修復(fù)處理，滴加3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶活性，PBS緩沖液沖洗，再用正常羊血清做封閉處理，滴加一抗(IGF-Ⅱ單克隆抗體、IGFBP-1單克隆抗體和抵抗素多克隆抗體，生物學(xué)效價(jià)為1∶50)置于4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，再用PBS緩沖液沖洗處理3次，滴加二抗(通用型SP9000 復(fù)合物)并置于37℃環(huán)境下孵育0.5 h，用PBS 沖洗處理2次，再滴加三抗(SP 復(fù)合物)后置于37℃環(huán)境下孵育0.5 h，用PBS緩沖液沖洗處理2次。最后做DAB/H2O2染色處理5 min，用生活用水反復(fù)沖洗，蘇木精復(fù)染1 min，常規(guī)制作切片于顯微鏡下觀察。

1.5 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 鏡下觀察各樣本免疫染色情況，胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃色沉著顆粒，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰即視為陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)，高倍鏡下選擇5個(gè)不同視野參考 Fromowitz 綜合積分原則對(duì)各胎盤(pán)樣本中IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)進(jìn)行評(píng)分[7]。按照染色程度進(jìn)行評(píng)分：與背景色相比，細(xì)胞內(nèi)染色不清或無(wú)染色時(shí)計(jì)0分；細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量淺黃色，染色程度高于背景色時(shí)計(jì)1分；細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多黃色或棕黃色顆粒時(shí)計(jì)2分；細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)著色均勻，可見(jiàn)大量棕黃色或深棕黃色顆粒時(shí)計(jì)3分。按照陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)計(jì)0分；陽(yáng)性細(xì)胞<25%計(jì)1分；25%<陽(yáng)性細(xì)胞<50%計(jì)2分；>50%計(jì)3分。

將上述2項(xiàng)積分之和作為評(píng)估結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：0～1分即為(-)，2～3分即為(+)，4～5分即為()，5分以上即為()。(陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性)÷各組患者例數(shù)×100%=陽(yáng)性率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以n(%)形式表達(dá)，組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用χ2檢驗(yàn)，多個(gè)樣本采用行×列卡方；IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對(duì)照組IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)情況 結(jié)果(表1)表明：IGF-Ⅱ在對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于病例組(P<0.01)，IGFBP-1、抵抗素在對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于病例組(P<0.01)。

表1 病例組和對(duì)照組IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)情況 n(%)

2.2 病例組IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)情況 根據(jù)HDCP病情從輕到重的程度，將病例組分為妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期3組。結(jié)果(表2、圖1～圖3)表明：IGF-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)率隨病情加重逐漸降低，IGFBP-1和抵抗素陽(yáng)性表達(dá)率隨病情加重逐漸升高，重度子癇前期組IGFBP-1、抵抗素的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于妊娠期高血壓組，重度子癇前期組IGF-Ⅱ的陽(yáng)性表達(dá)水平明顯低于輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)相關(guān)性分析 抵抗素與IGFBP-1表達(dá)正相關(guān)(r=0.593 7，P<0.05)，與IGF-Ⅱ表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.678 5，P<0.05)，IGFBP-1與IGF-Ⅱ表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.677 4，P<0.05)。

表2 病例組內(nèi)IGF-Ⅱ、IGFBP-1、抵抗素表達(dá)情況 n(%)

*P<0.05與妊娠期高血壓組相比，△P<0.05與輕度子癇前期相比

圖1 IGF-Ⅱ在不同組內(nèi)表達(dá)情況

A: IGF-Ⅱ在正常胎盤(pán)組織中的表達(dá)；B: IGF-Ⅱ在妊娠期高血壓胎盤(pán)組織中的表達(dá)；C: IGF-Ⅱ在輕度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá)；D: IGF-Ⅱ在重度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá). Original magnification：×100

圖2 IGFBP-1在不同組內(nèi)表達(dá)情況

A: IGFBP-1在正常胎盤(pán)組織中的表達(dá)；B: IGFBP-1在妊娠期高血壓胎盤(pán)組織的表達(dá)；C: IGFBP-1在輕度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá)；D: IGFBP-1在重度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá). Original magnification：×100

圖3 抵抗素在不同組內(nèi)表達(dá)情況

A: 抵抗素在正常胎盤(pán)組織中的表達(dá)；B: 抵抗素在妊娠期高血壓胎盤(pán)組織中的表達(dá)；C: 抵抗素在輕度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá)；D: 抵抗素在重度子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá). Original magnification：×100

2.4 不同預(yù)后HDCP患者 IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素表達(dá)情況比較 120例HDCP患者發(fā)生胎兒生長(zhǎng)受限23例，新生兒窒息17例，死亡1例，其中4例患者同時(shí)伴胎兒生長(zhǎng)受限和新生兒窒息，總共37例不良預(yù)后患者。結(jié)果(表3)表明：預(yù)后不良組 IGF-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)明顯低于預(yù)后良好組，而IGFBP-1 和抵抗素陽(yáng)性表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同預(yù)后妊高癥患者 IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素表達(dá) n (%)

3 討 論

HDCP是妊娠期女性最常見(jiàn)并發(fā)癥之一[8]。目前關(guān)于HDCP的具體發(fā)病機(jī)制依然不十分明確，但是較一致的理論認(rèn)為：該病起源于胎盤(pán)病理改變，胎盤(pán)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞因受各種因素影響導(dǎo)致其浸潤(rùn)、侵蝕能力減弱，抑制了螺旋動(dòng)脈重構(gòu)過(guò)程，進(jìn)而造成胎盤(pán)血流灌注不足，使其長(zhǎng)期處于缺血、缺氧狀態(tài)，最終導(dǎo)致母體血壓升高、內(nèi)皮功能損傷等情況的發(fā)生[9]。臨床有研究[10-11]顯示，IGF-Ⅱ、IGFBP-1是影響胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)、侵蝕能力的因素之一。IGF-Ⅱ?qū)儆趩坞念?lèi)物質(zhì)，可抑制脂肪降解，刺激蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖原以及碳水化合物代謝，并促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，可同滋養(yǎng)細(xì)胞IGF-Ⅱ受體相互結(jié)合從而提升滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)、侵入作用，促進(jìn)胚胎著床[12]。Shin 等[13]用蛋白印跡技術(shù)分析了正常妊娠產(chǎn)婦和HDCP患者中IGF-Ⅱ的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HDCP患者胎盤(pán)IGF-Ⅱ表達(dá)水平顯著降低，且與病情嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)。姚金翠等[14]同樣報(bào)道：HDCP患者胎盤(pán)組織中IGF-Ⅱ水平與妊娠期高血壓疾病嚴(yán)重程度負(fù)相關(guān)。

IGFBP-1是由肝、腎、子宮等器官組織分泌的激素之一，同時(shí)屬于IGF結(jié)合蛋白家族成員之一，其本身具備自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的作用，且臨床研究已證實(shí)IGFBP-1是參與IGF-1調(diào)節(jié)作用的重要因子，同時(shí)具備促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制代謝、促進(jìn)血糖升高等獨(dú)立于IGF作用之外的功效，是蛻膜過(guò)程中表達(dá)最豐富的蛋白。早期研究報(bào)道蛻膜可抑制胚泡著床，提示在母胎相互作用過(guò)程中IGFBP-1可能發(fā)揮局部調(diào)節(jié)作用，而IGFBP-1異常表達(dá)可能會(huì)誘發(fā)孕產(chǎn)婦妊娠期相關(guān)并發(fā)癥[15-16]。本研究結(jié)果顯示，IGF-Ⅱ在正常孕婦胎盤(pán)組織中鏡下可見(jiàn)大量棕黃色或深棕黃色沉著顆粒。而IGFBP-1在HDCP患者特別是重度子癇前期患者的胎盤(pán)組織中大量表達(dá)，并且隨著妊娠期高血壓疾病逐漸加重，胎盤(pán)組織中IGFBP-1表達(dá)逐漸升高，IGF-Ⅱ表達(dá)隨之下降。這一結(jié)果說(shuō)明IGFBP-1水平升高會(huì)導(dǎo)致游離狀態(tài)的IGF-Ⅱ水平下降，因此IGFBP-1與IGF-Ⅱ表達(dá)負(fù)相關(guān) ，這與以往Paul等[17]的研究結(jié)果相一致。該研究[17]認(rèn)為IGFBP-1可能抑制IGF-Ⅱ的生物學(xué)活性，而IGF-Ⅱ 既可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、分化和遷移，也可促進(jìn)蛋白酶的分泌及胚泡植入，IGFBP-1 通過(guò)對(duì)IGF-Ⅱ的影響，有可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕障礙，從而引發(fā)HDCP。

抵抗素是具有胰島素抵抗作用的脂肪因子，近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)抵抗素的蛋白分子結(jié)構(gòu)與炎癥因子相似，在脂肪細(xì)胞、單核細(xì)胞中均可表達(dá)，同時(shí)促炎細(xì)胞因子能明顯提升人單核細(xì)胞中抵抗素的表達(dá)，故將抵抗素視為炎性細(xì)胞因子的效應(yīng)因子，具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性作用[18]。近年來(lái)的研究顯示抵抗素與HDCP的發(fā)病密切相關(guān)[2,19]，而本研究結(jié)果同樣證實(shí)抵抗素在HDCP的胎盤(pán)組織中表達(dá)水平高于正常妊娠的胎盤(pán)組織，并且與IGFBP-1表達(dá)正相關(guān)，與IGF-Ⅱ表達(dá)負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果證實(shí)抵抗素水平與HDCP的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，原因可能是因?yàn)檠苤厮苷系K，血管內(nèi)環(huán)境功能紊亂等一系列病理生理改變導(dǎo)致HDCP發(fā)病，而抵抗素在這一過(guò)程中能夠促使母體的血管內(nèi)皮發(fā)生損傷[20]，而血管內(nèi)皮的損傷又間接導(dǎo)致了細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的入侵能力下降，反射性影響了IGF-Ⅱ和IGFBP-1水平表達(dá)，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素可能與HDCP發(fā)病及病情嚴(yán)重程度具有一定的相關(guān)性，而目前對(duì)于3種指標(biāo)是否與HDCP的妊娠結(jié)局是否存在相關(guān)性，罕有相關(guān)報(bào)道。為此，本研究進(jìn)一步觀察了預(yù)后不良HDCP患者和預(yù)后良好組患者的胎盤(pán)IGF-Ⅱ、IGFBP-1和抵抗素的陽(yáng)性表達(dá)情況，結(jié)果顯示預(yù)后不良的患者胎盤(pán)組織IGF-Ⅱ表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好組，而IGFBP-1水平和抵抗素表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好組。結(jié)果說(shuō)明3種指標(biāo)與HDCP的妊娠結(jié)局具有一定的關(guān)系，這3種指標(biāo)的變化可能與HDCP胎盤(pán)供血不足、缺血缺氧、功能障礙等情況密切相關(guān)，從側(cè)面反映了與胎盤(pán)功能有關(guān)，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。隨著妊娠期高血壓病逐漸加重，胎盤(pán)組織中IGF-Ⅱ表達(dá)隨之下降，抵抗素、IGFBP-1表達(dá)逐漸升高， 并且3種因子在HDCP胎盤(pán)組織中存在相關(guān)性，提示3種因子可能在HDCP的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，同時(shí)3種指標(biāo)與妊娠結(jié)局可能存在一定的關(guān)系，但是3種指標(biāo)是否可作為預(yù)測(cè)和判斷HDCP的發(fā)生、嚴(yán)重程度及妊娠結(jié)局的指標(biāo)，尚需進(jìn)一步的研究。