陳美標(biāo) 李 娟 陳杰忠 朱紅惠 姚 青1,③

(1廣東省微生物研究所/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510070；2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院 廣東廣州 510225；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/廣東省荔枝工程研究中心/廣東省微生物信號與病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東廣州 510642)

植物激素多胺(PAs)是小分子含氮化合物，有2個(gè)或2個(gè)以上含胺基團(tuán)。在植物組織中，腐胺(PUT)、亞精胺(SPD)和精胺(SPM)是主要的多胺類型，且大多以游離態(tài)形式存在。植物組織中的多胺具有強(qiáng)烈的生物活性，參與了花芽分化、胚形成、器官發(fā)生、衰老、果實(shí)發(fā)育與成熟等生理過程[1]；更為重要的是多胺能夠調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)[2]，在作物的抗逆栽培中展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。在果樹栽培中，多胺的研究和應(yīng)用得到了廣泛的重視，研究內(nèi)容涉及側(cè)根發(fā)生和根系生長等根系生理過程、花芽分化與授粉受精等生殖生理過程、幼果細(xì)胞分裂與果實(shí)成熟等果實(shí)發(fā)育生理過程[3]。在抗逆栽培方面，在干旱脅迫下施用外源Spd顯著提高杏幼苗葉片的光合作用，增強(qiáng)其抗性[4]；在鹽脅迫下施用3種外源多胺均可提高冬棗的光合速率，其中PUT和SPD的效應(yīng)較強(qiáng)[5]；在鹽堿脅迫下，施用外源3種外源多胺減輕了蘋果幼苗葉片的失綠癥狀，其中PUT的效應(yīng)較強(qiáng)[6]。這些研究表明，多胺不僅參與了果樹的許多生理過程，而且施用外源多胺能夠有效地提高果樹對逆境環(huán)境的適應(yīng)性。

柑橘是中國華南紅壤區(qū)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培果樹樹種之一，然而該區(qū)域的柑橘栽培面臨諸多逆境條件，對柑橘的可持續(xù)生產(chǎn)形成挑戰(zhàn)。盡管華南降水充沛，但是存在明顯的季節(jié)性分布不均[7]，全年高達(dá)70%的降水發(fā)生在4～9月，而10月至次年3月存在干旱問題[8]；高溫持續(xù)時(shí)間長、極端溫度高，經(jīng)常發(fā)生日灼現(xiàn)象，對果面造成損傷[9]；濕熱環(huán)境條件下病害頻發(fā)，增加柑橘園管理的難度和成本；紅壤鹽基離子含量低，養(yǎng)分不足，嚴(yán)重制約管理水平低的果園的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，多胺在華南紅壤區(qū)的柑橘抗逆栽培中可能具有很好的應(yīng)用前景。比如，楊楓等[10]的研究指出，施用0.4 mmol/L的外源SPD能夠顯著提高甜橙對潰瘍病的抗性；Khoshbakht等[11]發(fā)現(xiàn)，葉片噴施0.5 mmol/L的外源SPD減輕了柑橘的鹽脅迫傷害，光合速率增強(qiáng)，植株生物量和枝梢長度顯著增加；Xiong等[12]向柑橘的葉面和果面噴施0.5～1.5 mmol/L的外源SPD，能夠顯著降低果實(shí)的粗皮現(xiàn)象，并分析指出這與減輕氧化脅迫有關(guān)；Fu等[13]則證實(shí)了1 mmol/L的外源SPM能減輕高溫和干旱對枳的傷害。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，外源多胺確實(shí)能夠提高柑橘對脅迫環(huán)境的適應(yīng)性，從而推動(dòng)華南柑橘產(chǎn)區(qū)的抗逆栽培發(fā)展。

由于對環(huán)境存在潛在的污染，外源化學(xué)物質(zhì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的施用近年來受到廣泛的挑戰(zhàn)。因此，利用生物措施調(diào)控柑橘組織中的多胺水平是一個(gè)可行的策略。研究指出，叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌可以提高許多植株的多胺含量[14-15]。AM真菌是一類與絕大多數(shù)陸生植物根系共生的土壤真菌，能夠促進(jìn)植物對各種脅迫的抗性，如干旱[16]、高溫[17]、病害[18]，提高根系對養(yǎng)分的吸收[19]；AM真菌也能夠提高許多植物的內(nèi)源多胺水平或者改變內(nèi)源多胺的平衡，如小麥[15]、葡萄[20]；同樣，接種AM真菌也顯著提高了柑橘的多胺水平[21]。這為利用AM真菌調(diào)控柑橘的多胺水平，從而實(shí)現(xiàn)柑橘的康逆栽培提供了環(huán)境友好的生物學(xué)途徑。

不同AM真菌對柑橘的生長促進(jìn)效應(yīng)并不相同，因此，該課題組推測不同AM真菌提高柑橘多胺水平的程度也可能存在差異?；诖?，本課題組比較了4種AM真菌對柑橘幼苗的多胺水平的影響，為篩選最佳的AM真菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)以 ‘暗柳橙’(Citrus sinensisOsbeck‘Anliucheng’)為供試植物，以蘇格蘭斗管囊霉(Funneliformis caledonium，F(xiàn)C)、球狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita，GM)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae，F(xiàn)M)、變形球囊霉(Glomus versiforme，GV)4個(gè)AM真菌菌種為供試真菌，進(jìn)行接種試驗(yàn)。 ‘暗柳橙’果實(shí)從市場購買，取種子后洗凈待用；AM真菌菌種由廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供，經(jīng)三葉草擴(kuò)繁獲得本試驗(yàn)所用的菌劑。

本試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn)，塑料盆上徑12 cm、下徑10 cm、 高10 cm， 以滅菌(121℃，2 h 2次)的柑橘園紅壤為供試土壤。 ‘暗柳橙’種子經(jīng)10%的NaClO3表面消毒后在滅菌蛭石中萌芽、培養(yǎng)4周(光照培養(yǎng)箱，25℃)，然后選大小一致的苗子移栽到塑料盆中，每個(gè)根箱1株苗。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為接種F.caledonium(FC)、接種G.margarita(GM)、接種F.mosseae(FM)、接種G.versiforme(GV)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，接種處理按照20%的接種量將菌劑與土壤均勻混合。所有塑料盆置于自然光照的玻璃溫室中，水分管理按照18%的含水量隔天進(jìn)行稱重澆水，每2周澆一次20 mL的Hoagland營養(yǎng)液(磷1/4強(qiáng)度)。 植株生長20周后取樣測定。

1.2.2 取樣與測定

取樣后將植株用自來水洗凈，地上部與根系分離后分別測定鮮重。部分細(xì)根剪成2～3 cm長的根段，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行曲利苯藍(lán)染色，用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)觀察并對菌根侵染率進(jìn)行量化[22]。

PAs的提取參照文獻(xiàn)[23-24] 的方法進(jìn)行：分別稱取1g葉片或嫩根，在5 mL 5%(m/V)預(yù)冷的高氯酸中冰浴研磨成勻漿，冰浴提取2 h，4℃離心20 min(16 000 r/min)，收集上清液；沉淀再加2.5 mL 5%預(yù)冷的高氯酸進(jìn)行提取，收集并合并上清液；取4mL上清液，加入4mL2mol/L NaOH，40L苯甲酰氯，震蕩，30℃水浴30min，加入8 mL飽和NaCl，8 mL冷乙醚，震蕩，4℃離心10 min(3000 r/min)，收集全部上層乙醚相，用氮?dú)獯蹈?，殘留物立即? mL60%甲醇(色譜純)溶解，用混勻器高速震蕩10 s，有機(jī)濾頭過慮后用于測定游離態(tài)多胺含量。下層用4 mL5%(m/V)高氯酸懸浮，轉(zhuǎn)入離心管后用4mL12 mol/L HCl洗凈剩余殘?jiān)?，混合，震蕩，?10℃烘箱連續(xù)水解24 h，4℃離心30 min(8 000 r/min)，取上清液6 mL于培養(yǎng)皿中，80℃烘箱干燥，用1 mL 5%(m/V)高氯酸溶解后轉(zhuǎn)入離心管，加入1 mL 2 mol/L NaOH,苯甲酰氯10 L，震蕩10 s后30℃水浴30 min，然后加入2 mL飽和NaCl，2 mL冷乙醚，震蕩10 s，4℃離心10 min(3 000 r/min)，收集全部乙醚相，用氮?dú)獯蹈?，殘留物立即?.8 mL 60%甲醇(色譜純)溶解，用混勻器高速震蕩10 s，有機(jī)濾頭過濾后用于測定結(jié)合態(tài)多胺含量。

PAs含量的測定采用高效液相色譜法(HPLC)，測定方法參照文獻(xiàn)[25] 的方法略加改進(jìn)。高效液相色譜儀為Agilent 1100 series，紫外檢測器為VWD G1314A，波長254 nm，色譜柱為Hypersil ODS反向柱(5 m，5.0 mm×250 mm)柱溫35℃，流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水＝64∶2.5∶33.5，流速為0.6 mL/min。待測樣品用1 mL 60%甲醇(V/V)溶解，用有機(jī)濾頭過慮(有機(jī)系，孔徑為0.45m)后上機(jī)測定。進(jìn)樣量為10 L，用外標(biāo)法定量計(jì)算，單位為nmol/g FW。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值，鄧肯氏多重比較和聚類分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21v進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AM真菌的侵染率及對植株生長的影響

顯微觀察證實(shí)，AM真菌侵染了所有植株的根系，根內(nèi)主要的AM真菌結(jié)構(gòu)是叢枝和內(nèi)生菌絲，根系表面附著大量的外生菌絲(圖1)。4個(gè)菌種對柑橘根系的侵染程度在34.3%～56.0%，菌種之間沒有顯著差異(圖2)。比較接種4個(gè)菌種的植株的生物量可以發(fā)現(xiàn)，盡管地上部鮮重不存在顯著差異，但是摩西斗管囊霉接種的植株根系鮮重最大，顯著高于蘇格蘭斗管囊霉接種的植株根系鮮重(圖2)，整個(gè)植株的鮮重與根系鮮重的趨勢一致。此外，不同菌株對根冠比沒有產(chǎn)生顯著影響(圖2)。

圖1 AM真菌對柑橘根系的侵染

圖2 不同AM真菌菌種對柑橘根系的侵染和對植株生長的影響

2.2 不同AM真菌對植株的游離態(tài)多胺含量的影響

從圖3可以看到，葉片中檢出PUT、SPD和SPM全部3種多胺的游離態(tài)，而根系中SPM的游離態(tài)僅在接種變形球囊霉的植株中檢出；就PUT和SPD而言，根系中游離態(tài)多胺的含量高于葉片中游離態(tài)多胺的含量。葉片中游離態(tài)PUT和SPD在不同菌種間沒有顯著差異，但是接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中游離態(tài)SPM的含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株；根系中游離態(tài)SPD在不同菌種間也沒有顯著差異，但是接種變形球囊霉的植株根系中游離態(tài)PUT的含量顯著高于接種摩西斗管囊霉的植株。這些結(jié)果表明，接種不同AM真菌菌種對柑橘植株中游離態(tài)多胺的含量的影響存在顯著差異。

多胺對植株抗逆性的影響不僅體現(xiàn)在含量上，更重要的是不同多胺之間的平衡。表1的數(shù)據(jù)表明，葉片中PUT/PAs和(SPD+SPM)/PUT在4個(gè)菌種間沒有顯著差異，但是根系中PUT/PAs在不同菌種間存在顯著差異，接種變形球囊霉的植株根系中PUT/PAs顯著高于接種球狀巨孢囊霉和摩西斗管囊霉的植株，其中接種摩西斗管囊霉的植株根系中PUT/PAs最低(表1)。

圖3 不同AM真菌菌種對柑橘葉片和根系中游離態(tài)多胺含量的影響

表1 4接種AM真菌對游離態(tài)多胺平衡的影響

2.3 AM真菌對植株的結(jié)合態(tài)多胺含量的影響

結(jié)合態(tài)PUT、SPD和SPM在所有樣品中均有檢出，總體而言，葉片中的含量高于根系中的含量；葉片和根系中SPD含量最高(圖4)。接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)PUT含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株、接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)SPD含量顯著高于接種摩西斗管囊霉的植株，而接種摩西斗管囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)SPM含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株；根系中結(jié)合態(tài)多胺的含量在4個(gè)菌種間沒有顯著差異(圖4)。

圖4 不同AM真菌菌種對柑橘葉片和根系中結(jié)合態(tài)多胺含量的影響

2.4 不同AM真菌影響植株多胺代謝的聚類分析

為了探討哪些菌種對柑橘植株的多胺代謝具有相似的影響，本課題組基于不同形態(tài)多胺的含量及其平衡等19個(gè)指標(biāo)，對4種AM真菌菌種進(jìn)行聚類。結(jié)果表明，摩西斗管囊霉單獨(dú)聚成一類，而蘇格蘭斗管囊霉和變形球囊霉聚在一組，球狀巨孢囊霉則與蘇格蘭斗管囊霉、變形球囊霉組更為接近(圖5)。結(jié)合植株生物量的數(shù)據(jù)，接種摩西斗管囊霉的植株鮮重最高、接種蘇格蘭斗管囊霉的植株鮮重最低，推測AM真菌對多胺代謝的差異性影響是導(dǎo)致植株鮮重差異的原因之一。

圖5 基于多胺含量指標(biāo)的不同AM真菌菌種的聚類分析

3 討論

AM真菌是華南果園土壤中常見的習(xí)居有益共生微生物，能夠與許多熱帶亞熱帶果樹建立共生關(guān)系[26]，AM真菌在柑橘的抗逆栽培中的重要性已經(jīng)得到廣泛證實(shí)[16-19]。盡管前人大量的研究表明，促進(jìn)根系對養(yǎng)分的吸收是AM真菌提高柑橘抗逆性的重要機(jī)制，但是也有研究表明，AM真菌對柑橘植株的多胺代謝的調(diào)控也是增強(qiáng)抗逆性的機(jī)制之一[21,27]。在此基礎(chǔ)上，本研究比較了4種AM真菌菌種對柑橘多胺代謝的影響，發(fā)現(xiàn)不同菌種之間存在顯著差異，不僅體現(xiàn)在不同多胺組分的含量上，也體現(xiàn)在不同多胺組分的平衡上。

本研究發(fā)現(xiàn)，在供試的蘇格蘭斗管囊霉、球狀巨孢囊霉、摩西斗管囊霉和變形球囊霉中，接種摩西斗管囊霉的植株的生物量最高；而在基于多胺含量的聚類分析中，摩西斗管囊霉也單獨(dú)聚為一組，表明多胺可能與AM真菌對柑橘植株生物量的影響密切相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)致分析可以發(fā)現(xiàn)，接種摩西斗管囊霉的植株的葉片和根系中PUT/PAs最低，而(SPD＋SPM)/PUT最高，表明多胺的平衡可能在AM真菌調(diào)控柑橘植株生長上比多胺的含量更為重要。PUT/PAs和(SPD＋SPM)/PUT這2個(gè)指標(biāo)是衡量多胺增強(qiáng)植株抗逆性的常用指標(biāo)[28-30]。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，生姜受到的低溫脅迫越強(qiáng)，則PUT/PAs值越高；賈永霞等[29]認(rèn)為，外源SPD可以通過降低PUT/PAs、增加(SPD＋SPM)/PUT來提高黃瓜幼苗對低氧脅迫的抗性；劉建新等[30]發(fā)現(xiàn)，較低的PUT/PAs和較高的(SPD＋SPM)/PUT與燕麥的鹽堿脅迫強(qiáng)度正相關(guān)。本研究中沒有對柑橘植株施加脅迫處理，但是自然光照的溫室條件下，輕微的高溫、干旱等脅迫很可能可能是客觀存在的。這表明，接種不同AM真菌菌種的生物量存在差異，部分的原因是它們對柑橘的多胺代謝，尤其是多胺的平衡，產(chǎn)生了不同的影響。

施用外源多胺可以增強(qiáng)植株的抗逆性。本研究證實(shí)了接種AM真菌可以替代外源多胺的施用，調(diào)控柑橘植株的多胺代謝水平，且存在菌種的差異。但是，存在2個(gè)問題需要將來加以研究：一是不同AM真菌菌種引起的這種多胺代謝的差異是否真的導(dǎo)致其抗性的差異？需要通過施加不同脅迫處理的試驗(yàn)加以證實(shí)；二是本研究只是比較了4個(gè)菌種之間的差異，因?yàn)榇藳]有設(shè)置不接種對照，如果要探討接種AM真菌是否真的可以替代外源多胺，需要設(shè)置不接種AM真菌但是施用外源多胺的處理進(jìn)行比較。Wu等[21]比較了接種和未接種摩西斗管囊霉(FM)的柑橘植株多胺代謝差異，指出AM真菌通過調(diào)控參與多胺代謝的酶活性(如精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、二胺氧化酶、多胺氧化酶)來改變柑橘植株的內(nèi)源多胺含量。

總體而言，本研究揭示了不同AM真菌菌種對柑橘的多胺代謝的影響模式是不同的，這種差異可能與其生長促進(jìn)效應(yīng)有一定的關(guān)系；與多胺的含量相比，多胺的平衡可能是AM真菌影響柑橘生物量的更重要的原因；在供試的4個(gè)菌種中，摩西斗管囊霉對多胺的調(diào)控模式更有利于促進(jìn)柑橘植株生長。本研究結(jié)果為在華南紅壤中應(yīng)用AM真菌開展柑橘的抗逆栽培以及開展菌種優(yōu)選的必要性提供一定的依據(jù)。