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        紅壤中不同AM真菌侵染的柑橘中多胺含量的比較①

        2019-08-23 11:10:38陳美標(biāo)陳杰忠朱紅惠青1
        熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年5期

        陳美標(biāo) 李 娟 陳杰忠 朱紅惠 姚 青1,③

        (1廣東省微生物研究所/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東廣州 510070;2仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院 廣東廣州 510225;3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/廣東省荔枝工程研究中心/廣東省微生物信號與病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東廣州 510642)

        植物激素多胺(PAs)是小分子含氮化合物,有2個(gè)或2個(gè)以上含胺基團(tuán)。在植物組織中,腐胺(PUT)、亞精胺(SPD)和精胺(SPM)是主要的多胺類型,且大多以游離態(tài)形式存在。植物組織中的多胺具有強(qiáng)烈的生物活性,參與了花芽分化、胚形成、器官發(fā)生、衰老、果實(shí)發(fā)育與成熟等生理過程[1];更為重要的是多胺能夠調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)[2],在作物的抗逆栽培中展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。在果樹栽培中,多胺的研究和應(yīng)用得到了廣泛的重視,研究內(nèi)容涉及側(cè)根發(fā)生和根系生長等根系生理過程、花芽分化與授粉受精等生殖生理過程、幼果細(xì)胞分裂與果實(shí)成熟等果實(shí)發(fā)育生理過程[3]。在抗逆栽培方面,在干旱脅迫下施用外源Spd顯著提高杏幼苗葉片的光合作用,增強(qiáng)其抗性[4];在鹽脅迫下施用3種外源多胺均可提高冬棗的光合速率,其中PUT和SPD的效應(yīng)較強(qiáng)[5];在鹽堿脅迫下,施用外源3種外源多胺減輕了蘋果幼苗葉片的失綠癥狀,其中PUT的效應(yīng)較強(qiáng)[6]。這些研究表明,多胺不僅參與了果樹的許多生理過程,而且施用外源多胺能夠有效地提高果樹對逆境環(huán)境的適應(yīng)性。

        柑橘是中國華南紅壤區(qū)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培果樹樹種之一,然而該區(qū)域的柑橘栽培面臨諸多逆境條件,對柑橘的可持續(xù)生產(chǎn)形成挑戰(zhàn)。盡管華南降水充沛,但是存在明顯的季節(jié)性分布不均[7],全年高達(dá)70%的降水發(fā)生在4~9月,而10月至次年3月存在干旱問題[8];高溫持續(xù)時(shí)間長、極端溫度高,經(jīng)常發(fā)生日灼現(xiàn)象,對果面造成損傷[9];濕熱環(huán)境條件下病害頻發(fā),增加柑橘園管理的難度和成本;紅壤鹽基離子含量低,養(yǎng)分不足,嚴(yán)重制約管理水平低的果園的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,多胺在華南紅壤區(qū)的柑橘抗逆栽培中可能具有很好的應(yīng)用前景。比如,楊楓等[10]的研究指出,施用0.4 mmol/L的外源SPD能夠顯著提高甜橙對潰瘍病的抗性;Khoshbakht等[11]發(fā)現(xiàn),葉片噴施0.5 mmol/L的外源SPD減輕了柑橘的鹽脅迫傷害,光合速率增強(qiáng),植株生物量和枝梢長度顯著增加;Xiong等[12]向柑橘的葉面和果面噴施0.5~1.5 mmol/L的外源SPD,能夠顯著降低果實(shí)的粗皮現(xiàn)象,并分析指出這與減輕氧化脅迫有關(guān);Fu等[13]則證實(shí)了1 mmol/L的外源SPM能減輕高溫和干旱對枳的傷害。這些試驗(yàn)結(jié)果表明,外源多胺確實(shí)能夠提高柑橘對脅迫環(huán)境的適應(yīng)性,從而推動(dòng)華南柑橘產(chǎn)區(qū)的抗逆栽培發(fā)展。

        由于對環(huán)境存在潛在的污染,外源化學(xué)物質(zhì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的施用近年來受到廣泛的挑戰(zhàn)。因此,利用生物措施調(diào)控柑橘組織中的多胺水平是一個(gè)可行的策略。研究指出,叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌可以提高許多植株的多胺含量[14-15]。AM真菌是一類與絕大多數(shù)陸生植物根系共生的土壤真菌,能夠促進(jìn)植物對各種脅迫的抗性,如干旱[16]、高溫[17]、病害[18],提高根系對養(yǎng)分的吸收[19];AM真菌也能夠提高許多植物的內(nèi)源多胺水平或者改變內(nèi)源多胺的平衡,如小麥[15]、葡萄[20];同樣,接種AM真菌也顯著提高了柑橘的多胺水平[21]。這為利用AM真菌調(diào)控柑橘的多胺水平,從而實(shí)現(xiàn)柑橘的康逆栽培提供了環(huán)境友好的生物學(xué)途徑。

        不同AM真菌對柑橘的生長促進(jìn)效應(yīng)并不相同,因此,該課題組推測不同AM真菌提高柑橘多胺水平的程度也可能存在差異?;诖?,本課題組比較了4種AM真菌對柑橘幼苗的多胺水平的影響,為篩選最佳的AM真菌提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        本試驗(yàn)以 ‘暗柳橙’(Citrus sinensisOsbeck‘Anliucheng’)為供試植物,以蘇格蘭斗管囊霉(Funneliformis caledonium,F(xiàn)C)、球狀巨孢囊霉(Gigaspora margarita,GM)、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae,F(xiàn)M)、變形球囊霉(Glomus versiforme,GV)4個(gè)AM真菌菌種為供試真菌,進(jìn)行接種試驗(yàn)。 ‘暗柳橙’果實(shí)從市場購買,取種子后洗凈待用;AM真菌菌種由廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供,經(jīng)三葉草擴(kuò)繁獲得本試驗(yàn)所用的菌劑。

        本試驗(yàn)為盆栽試驗(yàn),塑料盆上徑12 cm、下徑10 cm、 高10 cm, 以滅菌(121℃,2 h 2次)的柑橘園紅壤為供試土壤。 ‘暗柳橙’種子經(jīng)10%的NaClO3表面消毒后在滅菌蛭石中萌芽、培養(yǎng)4周(光照培養(yǎng)箱,25℃),然后選大小一致的苗子移栽到塑料盆中,每個(gè)根箱1株苗。

        1.2 方法

        1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理,分別為接種F.caledonium(FC)、接種G.margarita(GM)、接種F.mosseae(FM)、接種G.versiforme(GV),每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),接種處理按照20%的接種量將菌劑與土壤均勻混合。所有塑料盆置于自然光照的玻璃溫室中,水分管理按照18%的含水量隔天進(jìn)行稱重澆水,每2周澆一次20 mL的Hoagland營養(yǎng)液(磷1/4強(qiáng)度)。 植株生長20周后取樣測定。

        1.2.2 取樣與測定

        取樣后將植株用自來水洗凈,地上部與根系分離后分別測定鮮重。部分細(xì)根剪成2~3 cm長的根段,根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行曲利苯藍(lán)染色,用光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)觀察并對菌根侵染率進(jìn)行量化[22]。

        PAs的提取參照文獻(xiàn)[23-24] 的方法進(jìn)行:分別稱取1g葉片或嫩根,在5 mL 5%(m/V)預(yù)冷的高氯酸中冰浴研磨成勻漿,冰浴提取2 h,4℃離心20 min(16 000 r/min),收集上清液;沉淀再加2.5 mL 5%預(yù)冷的高氯酸進(jìn)行提取,收集并合并上清液;取4mL上清液,加入4mL2mol/L NaOH,40L苯甲酰氯,震蕩,30℃水浴30min,加入8 mL飽和NaCl,8 mL冷乙醚,震蕩,4℃離心10 min(3000 r/min),收集全部上層乙醚相,用氮?dú)獯蹈?,殘留物立即? mL60%甲醇(色譜純)溶解,用混勻器高速震蕩10 s,有機(jī)濾頭過慮后用于測定游離態(tài)多胺含量。下層用4 mL5%(m/V)高氯酸懸浮,轉(zhuǎn)入離心管后用4mL12 mol/L HCl洗凈剩余殘?jiān)?,混合,震蕩,?10℃烘箱連續(xù)水解24 h,4℃離心30 min(8 000 r/min),取上清液6 mL于培養(yǎng)皿中,80℃烘箱干燥,用1 mL 5%(m/V)高氯酸溶解后轉(zhuǎn)入離心管,加入1 mL 2 mol/L NaOH,苯甲酰氯10 L,震蕩10 s后30℃水浴30 min,然后加入2 mL飽和NaCl,2 mL冷乙醚,震蕩10 s,4℃離心10 min(3 000 r/min),收集全部乙醚相,用氮?dú)獯蹈?,殘留物立即?.8 mL 60%甲醇(色譜純)溶解,用混勻器高速震蕩10 s,有機(jī)濾頭過濾后用于測定結(jié)合態(tài)多胺含量。

        PAs含量的測定采用高效液相色譜法(HPLC),測定方法參照文獻(xiàn)[25] 的方法略加改進(jìn)。高效液相色譜儀為Agilent 1100 series,紫外檢測器為VWD G1314A,波長254 nm,色譜柱為Hypersil ODS反向柱(5 m,5.0 mm×250 mm)柱溫35℃,流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水=64∶2.5∶33.5,流速為0.6 mL/min。待測樣品用1 mL 60%甲醇(V/V)溶解,用有機(jī)濾頭過慮(有機(jī)系,孔徑為0.45m)后上機(jī)測定。進(jìn)樣量為10 L,用外標(biāo)法定量計(jì)算,單位為nmol/g FW。

        1.2.3 數(shù)據(jù)處理

        所有數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值,鄧肯氏多重比較和聚類分析用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21v進(jìn)行分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同AM真菌的侵染率及對植株生長的影響

        顯微觀察證實(shí),AM真菌侵染了所有植株的根系,根內(nèi)主要的AM真菌結(jié)構(gòu)是叢枝和內(nèi)生菌絲,根系表面附著大量的外生菌絲(圖1)。4個(gè)菌種對柑橘根系的侵染程度在34.3%~56.0%,菌種之間沒有顯著差異(圖2)。比較接種4個(gè)菌種的植株的生物量可以發(fā)現(xiàn),盡管地上部鮮重不存在顯著差異,但是摩西斗管囊霉接種的植株根系鮮重最大,顯著高于蘇格蘭斗管囊霉接種的植株根系鮮重(圖2),整個(gè)植株的鮮重與根系鮮重的趨勢一致。此外,不同菌株對根冠比沒有產(chǎn)生顯著影響(圖2)。

        圖1 AM真菌對柑橘根系的侵染

        圖2 不同AM真菌菌種對柑橘根系的侵染和對植株生長的影響

        2.2 不同AM真菌對植株的游離態(tài)多胺含量的影響

        從圖3可以看到,葉片中檢出PUT、SPD和SPM全部3種多胺的游離態(tài),而根系中SPM的游離態(tài)僅在接種變形球囊霉的植株中檢出;就PUT和SPD而言,根系中游離態(tài)多胺的含量高于葉片中游離態(tài)多胺的含量。葉片中游離態(tài)PUT和SPD在不同菌種間沒有顯著差異,但是接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中游離態(tài)SPM的含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株;根系中游離態(tài)SPD在不同菌種間也沒有顯著差異,但是接種變形球囊霉的植株根系中游離態(tài)PUT的含量顯著高于接種摩西斗管囊霉的植株。這些結(jié)果表明,接種不同AM真菌菌種對柑橘植株中游離態(tài)多胺的含量的影響存在顯著差異。

        多胺對植株抗逆性的影響不僅體現(xiàn)在含量上,更重要的是不同多胺之間的平衡。表1的數(shù)據(jù)表明,葉片中PUT/PAs和(SPD+SPM)/PUT在4個(gè)菌種間沒有顯著差異,但是根系中PUT/PAs在不同菌種間存在顯著差異,接種變形球囊霉的植株根系中PUT/PAs顯著高于接種球狀巨孢囊霉和摩西斗管囊霉的植株,其中接種摩西斗管囊霉的植株根系中PUT/PAs最低(表1)。

        圖3 不同AM真菌菌種對柑橘葉片和根系中游離態(tài)多胺含量的影響

        表1 4接種AM真菌對游離態(tài)多胺平衡的影響

        2.3 AM真菌對植株的結(jié)合態(tài)多胺含量的影響

        結(jié)合態(tài)PUT、SPD和SPM在所有樣品中均有檢出,總體而言,葉片中的含量高于根系中的含量;葉片和根系中SPD含量最高(圖4)。接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)PUT含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株、接種球狀巨孢囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)SPD含量顯著高于接種摩西斗管囊霉的植株,而接種摩西斗管囊霉的植株葉片中結(jié)合態(tài)SPM含量顯著高于接種其他3個(gè)菌種的植株;根系中結(jié)合態(tài)多胺的含量在4個(gè)菌種間沒有顯著差異(圖4)。

        圖4 不同AM真菌菌種對柑橘葉片和根系中結(jié)合態(tài)多胺含量的影響

        2.4 不同AM真菌影響植株多胺代謝的聚類分析

        為了探討哪些菌種對柑橘植株的多胺代謝具有相似的影響,本課題組基于不同形態(tài)多胺的含量及其平衡等19個(gè)指標(biāo),對4種AM真菌菌種進(jìn)行聚類。結(jié)果表明,摩西斗管囊霉單獨(dú)聚成一類,而蘇格蘭斗管囊霉和變形球囊霉聚在一組,球狀巨孢囊霉則與蘇格蘭斗管囊霉、變形球囊霉組更為接近(圖5)。結(jié)合植株生物量的數(shù)據(jù),接種摩西斗管囊霉的植株鮮重最高、接種蘇格蘭斗管囊霉的植株鮮重最低,推測AM真菌對多胺代謝的差異性影響是導(dǎo)致植株鮮重差異的原因之一。

        圖5 基于多胺含量指標(biāo)的不同AM真菌菌種的聚類分析

        3 討論

        AM真菌是華南果園土壤中常見的習(xí)居有益共生微生物,能夠與許多熱帶亞熱帶果樹建立共生關(guān)系[26],AM真菌在柑橘的抗逆栽培中的重要性已經(jīng)得到廣泛證實(shí)[16-19]。盡管前人大量的研究表明,促進(jìn)根系對養(yǎng)分的吸收是AM真菌提高柑橘抗逆性的重要機(jī)制,但是也有研究表明,AM真菌對柑橘植株的多胺代謝的調(diào)控也是增強(qiáng)抗逆性的機(jī)制之一[21,27]。在此基礎(chǔ)上,本研究比較了4種AM真菌菌種對柑橘多胺代謝的影響,發(fā)現(xiàn)不同菌種之間存在顯著差異,不僅體現(xiàn)在不同多胺組分的含量上,也體現(xiàn)在不同多胺組分的平衡上。

        本研究發(fā)現(xiàn),在供試的蘇格蘭斗管囊霉、球狀巨孢囊霉、摩西斗管囊霉和變形球囊霉中,接種摩西斗管囊霉的植株的生物量最高;而在基于多胺含量的聚類分析中,摩西斗管囊霉也單獨(dú)聚為一組,表明多胺可能與AM真菌對柑橘植株生物量的影響密切相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)致分析可以發(fā)現(xiàn),接種摩西斗管囊霉的植株的葉片和根系中PUT/PAs最低,而(SPD+SPM)/PUT最高,表明多胺的平衡可能在AM真菌調(diào)控柑橘植株生長上比多胺的含量更為重要。PUT/PAs和(SPD+SPM)/PUT這2個(gè)指標(biāo)是衡量多胺增強(qiáng)植株抗逆性的常用指標(biāo)[28-30]。Li等[28]發(fā)現(xiàn),生姜受到的低溫脅迫越強(qiáng),則PUT/PAs值越高;賈永霞等[29]認(rèn)為,外源SPD可以通過降低PUT/PAs、增加(SPD+SPM)/PUT來提高黃瓜幼苗對低氧脅迫的抗性;劉建新等[30]發(fā)現(xiàn),較低的PUT/PAs和較高的(SPD+SPM)/PUT與燕麥的鹽堿脅迫強(qiáng)度正相關(guān)。本研究中沒有對柑橘植株施加脅迫處理,但是自然光照的溫室條件下,輕微的高溫、干旱等脅迫很可能可能是客觀存在的。這表明,接種不同AM真菌菌種的生物量存在差異,部分的原因是它們對柑橘的多胺代謝,尤其是多胺的平衡,產(chǎn)生了不同的影響。

        施用外源多胺可以增強(qiáng)植株的抗逆性。本研究證實(shí)了接種AM真菌可以替代外源多胺的施用,調(diào)控柑橘植株的多胺代謝水平,且存在菌種的差異。但是,存在2個(gè)問題需要將來加以研究:一是不同AM真菌菌種引起的這種多胺代謝的差異是否真的導(dǎo)致其抗性的差異?需要通過施加不同脅迫處理的試驗(yàn)加以證實(shí);二是本研究只是比較了4個(gè)菌種之間的差異,因?yàn)榇藳]有設(shè)置不接種對照,如果要探討接種AM真菌是否真的可以替代外源多胺,需要設(shè)置不接種AM真菌但是施用外源多胺的處理進(jìn)行比較。Wu等[21]比較了接種和未接種摩西斗管囊霉(FM)的柑橘植株多胺代謝差異,指出AM真菌通過調(diào)控參與多胺代謝的酶活性(如精氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、二胺氧化酶、多胺氧化酶)來改變柑橘植株的內(nèi)源多胺含量。

        總體而言,本研究揭示了不同AM真菌菌種對柑橘的多胺代謝的影響模式是不同的,這種差異可能與其生長促進(jìn)效應(yīng)有一定的關(guān)系;與多胺的含量相比,多胺的平衡可能是AM真菌影響柑橘生物量的更重要的原因;在供試的4個(gè)菌種中,摩西斗管囊霉對多胺的調(diào)控模式更有利于促進(jìn)柑橘植株生長。本研究結(jié)果為在華南紅壤中應(yīng)用AM真菌開展柑橘的抗逆栽培以及開展菌種優(yōu)選的必要性提供一定的依據(jù)。

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