孟鐵宏，李春榮，王 恒，姜艷萍，趙鴻賓，余躍生，胡先運(yùn),2*

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000;2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550002)

多巴胺(DA)是人體內(nèi)一種重要的兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)傳遞物質(zhì)，是體內(nèi)去甲腎上腺素或腎上腺素生物合成的前體，對(duì)神經(jīng)中樞、心血管、腎臟及激素分泌系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的精神活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用。若人體內(nèi)的多巴胺分泌不足，可能導(dǎo)致神經(jīng)肌肉失調(diào)[1]，甚至引發(fā)帕金森氏癥[2]、老年癡呆癥[3]、癲癇癥[4]、心臟病等疾病，因此，體內(nèi)多巴胺含量可作為臨床上一些疾病的重要診斷依據(jù)，對(duì)多巴胺進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)具有十分重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。已報(bào)道的多巴胺檢測(cè)方法主要有分光光度法[5]、熒光光度法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]、高效液相色譜法[8]、電化學(xué)分析法[9]等，其中，熒光光度法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、響應(yīng)線性范圍寬和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，廣受?chē)?guó)內(nèi)外研究者的青睞。

碳點(diǎn)(Carbon quantum dots，簡(jiǎn)稱CDs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種熒光性質(zhì)優(yōu)良的新型碳納米熒光材料，因具有良好的水溶性、生物相容性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，在離子傳感、生物傳感、細(xì)胞成像等方面得到了廣泛研究[12]。目前碳點(diǎn)的合成方法有化學(xué)氧化法[13]、水熱合成法[14]、微波法[15]、電化學(xué)法[16]等，在這些方法中，微波法能夠有效縮短反應(yīng)時(shí)間，且具有操作簡(jiǎn)單，制備成本低，快速便捷等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者關(guān)注[17-18]。

本研究以檸檬酸為碳源，尿素為氮源，采用微波一步法快速制備出穩(wěn)定性高，水溶性好，富含羥基、羧基和氨基的藍(lán)色熒光氮摻雜碳點(diǎn)(N-CDs)，基于多巴胺(DA)可以猝滅N-CDs熒光的特性，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的DA檢測(cè)方法。該方法具有良好的選擇性和較寬的檢測(cè)范圍，可用于正常人尿液中多巴胺含量的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

微波爐(格蘭仕集團(tuán))；Agilent Cary100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫科技公司)；F-7000熒光光譜儀(日本日立公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器公司)；HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋( 金壇市醫(yī)療儀器廠)；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)；Nicolet 5700型傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；ESCALab250 X-射線光電子能譜儀(美國(guó) Thermo公司)；FLS-920光譜儀(英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司)；DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

鹽酸多巴胺(純度≥ 99.0%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司)，檸檬酸、尿素(純度≥ 99.0%，九鼎化學(xué)(上海)科技有限公司)。其他所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 氮摻雜碳點(diǎn)的合成

準(zhǔn)確稱取0.5 g檸檬酸和0.3 g尿素于100 mL錐形瓶中，加水10 mL溶解，置于微波爐中央位置于高火檔(700 W)微波3 min，得到棕黑色物質(zhì)，將棕黑色物質(zhì)冷卻至室溫，加水溶解，然后離心10 min( 10 000 r/min)，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，再用截留量500 kD的透析袋透析24 h(每3 h換水一次)，除去未反應(yīng)的檸檬酸和尿素，制得純凈的N-CDs溶液。加適量水稀釋配制成濃度為0.3 mol/L的N-CDs母液(以碳計(jì))，儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱中備用。

1.3 量子產(chǎn)率

1.4 多巴胺的定量檢測(cè)

在系列5 mL離心管中依次加入0.4 mL N-CDs、0.4 mL B-R緩沖溶液和一定體積的DA標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.001 mol/L)或其他干擾物質(zhì)，用去離子水定容至4 mL，充分混勻后，放入45 ℃的恒溫水浴鍋中孵育4 h。隨后，將離心管從水浴鍋中取出，冷卻至室溫，于熒光光譜儀(λex=360 nm，λem=440 nm)上測(cè)定體系熒光強(qiáng)度(IF)，同時(shí)做DA 試劑空白(IF0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮摻雜碳點(diǎn)的表征

透射電鏡(TEM，圖1A)圖顯示，N-CDs在溶液中分散性良好，基本呈規(guī)則的球形。圖1B為N-CDs TEM 圖上統(tǒng)計(jì)的大約100個(gè)碳點(diǎn)的粒徑分布圖，由該圖可知，合成的N-CDs粒徑范圍為0.5～5 nm，主要分布在2.0～3.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為2.6 nm。圖1C為N-CDs的原子力顯微鏡(AFM)圖，由圖中可以看出，制備的N-CDs為規(guī)則的球形，AB段的平均高度在2.4 nm左右，與TEM的表征結(jié)果基本一致。兩種表征均在純水中進(jìn)行樣品制備，未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的超聲處理，說(shuō)明N-CDs在水中具有很好的分散性。

圖1 N-CDs的TEM(A)，粒徑分布(B)，AFM(C)圖和AFM圖中AB段的輪廓高度(D)Fig.1 TEM(A) and particle distribution(B) and atomic force microscope(C) images of N-CDs and profile height of AB section in AFM image(D)

圖2 氮摻雜碳點(diǎn)的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of N-CDs

圖3 N-CDs 的X-射線光電子能譜圖(A)和C1s(B)、 O1s(C)、N1s(D)高分辨能譜Fig.3 XPS(A) and C1s(B),O1s(C),and N1s(D) spectra of N-CDs

2.2 氮摻雜碳點(diǎn)的光學(xué)性能

對(duì)N-CDs進(jìn)行紫外吸收光譜和不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜掃描。N-CDs的吸收曲線從紫外區(qū)一直延伸到可見(jiàn)光區(qū)，且在240、340 nm處有吸收峰(圖4A，曲線a)。240 nm處的吸收峰可能是N-CDs內(nèi)部π-π*躍遷所致，而340 nm處的吸收峰則可能由N-CDs內(nèi)部n-π*電子的躍遷所產(chǎn)生[23]。N-CDs在360 nm最佳激發(fā)波長(zhǎng)(圖4A，曲線b)下可發(fā)射出455 nm(圖4A，曲線c)的熒光。由圖4A內(nèi)插圖可看出，N-CDs在日光燈照射下呈透明、均一的淡黃色溶液，而在365 nm的紫外燈照射下發(fā)出藍(lán)色熒光。

圖4 N-CDs的紫外光譜圖(A)和在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectrum(A)and fluorescence spectra of N-CDs under different excitation wavelengths insert:photographs of N-CDs solution under daylight(left) and UV light of 365 nm(right)

圖4B為不同激發(fā)波長(zhǎng)(320～410 nm，每次間隔10 nm)下N-CDs的熒光光譜。由圖可知，N-CDs熒光發(fā)射峰的位置和強(qiáng)度依賴于激發(fā)波長(zhǎng)。改變激發(fā)波長(zhǎng)，N-CDs的熒光發(fā)射峰和強(qiáng)度均隨之改變。隨著激發(fā)波長(zhǎng)由320 nm 增加到410 nm，熒光發(fā)射峰逐漸紅移，發(fā)射波長(zhǎng)由441 nm 紅移至519 nm，同時(shí)熒光強(qiáng)度先增大后減小。N-CDs的這一熒光特性，可能與其表面缺陷[24]及納米粒子粒徑對(duì)光的選擇性有關(guān)[25]。根據(jù)N-CDs的熒光強(qiáng)度變化，后續(xù)試驗(yàn)選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm。以硫酸奎寧(54%，0.1 mol/L H2SO4)為參考物質(zhì)，測(cè)得該N-CDs的熒光量子產(chǎn)率約為5.79%。

2.3 DA測(cè)定條件的優(yōu)化

考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和pH值對(duì)N-CDs測(cè)定DA的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5A為在pH 8.0 B-R緩沖溶液中反應(yīng)4 h后，不同溫度對(duì)DA猝滅N-CDs熒光的影響。結(jié)果顯示，常溫下DA 對(duì)N-CDs的熒光幾乎沒(méi)有猝滅作用，隨著溫度的升高，熒光猝滅逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度達(dá)45 ℃時(shí)，熒光猝滅程度基本達(dá)到最高，繼續(xù)升溫，猝滅效率改變很小。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在45 ℃下孵育一定時(shí)間后進(jìn)行熒光測(cè)定。

圖5B為45 ℃水浴鍋中，不同pH值條件下，孵育不同時(shí)間后N-CDs-DA 體系的熒光變化情況。結(jié)果表明，在pH 7.0條件下，隨著時(shí)間的增加，N-CDs-DA 體系的熒光強(qiáng)度變化不甚明顯。pH 8.0和pH 9.0時(shí)，隨著時(shí)間的增加，N-CDs-DA 體系的熒光強(qiáng)度快速降低，孵育時(shí)間超過(guò)4 h后，熒光強(qiáng)度下降趨緩，且兩種pH值條件下的熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)基本吻合。當(dāng)pH 10.0或pH 11.0時(shí)，隨著時(shí)間的增加，N-CDs-DA 體系的熒光強(qiáng)度先迅速降低(且pH值越大，下降越迅速)，后又隨著時(shí)間的增加緩慢升高(且pH值越大熒光強(qiáng)度增大趨勢(shì)越明顯)，其原因可能是在強(qiáng)堿性環(huán)境中，多巴胺容易發(fā)生聚合反應(yīng)形成聚多巴胺[26-27]。因此，實(shí)驗(yàn)選擇在pH 8.0，孵育溫度為45 ℃的條件下，孵育4 h后測(cè)定N-CDs-DA 體系的熒光強(qiáng)度。

圖5 溫度(A)和不同pH值條件下反應(yīng)時(shí)間(B)對(duì)N-CDs-DA體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of temperature(A) and reaction time under different pH conditions(B) on the fluorescence intensity of N-CDs-DA system

2.4 熒光壽命分析

對(duì)N-CDs和N-CDs-DA體系進(jìn)行熒光壽命測(cè)試，并對(duì)熒光衰減曲線進(jìn)行擬合，得到N-CDs猝滅前后的熒光壽命分別為10.20、8.90 ns。這是因?yàn)?堿性環(huán)境中DA被氧化成多巴胺醌，引起N-CDs熒光猝滅,導(dǎo)致其熒光壽命減弱，進(jìn)一步證明多巴胺醌引起的熒光猝滅是一種動(dòng)態(tài)猝滅。

2.5 多巴胺對(duì)氮摻雜碳點(diǎn)的熒光猝滅及其機(jī)理探討

常溫下，DA的加入對(duì) N-CDs 溶液的熒光強(qiáng)度無(wú)影響，只有在適宜的堿性條件和一定溫度下進(jìn)行孵育，DA才能有效猝滅N-CDs的熒光。在堿性環(huán)境中，DA可被O2氧化生成多巴胺醌，而多巴胺醌是強(qiáng)吸電子體[28]，結(jié)合反應(yīng)前后的熒光壽命分析，認(rèn)為DA猝滅N-CDs熒光的可能機(jī)理是電荷轉(zhuǎn)移。即在一定的溫度條件下，DA在堿性環(huán)境中被氧化生成多巴胺醌，多巴胺醌的強(qiáng)吸電子結(jié)構(gòu)使得當(dāng)其與N-CDs相互作用時(shí)，N-CDs的激發(fā)態(tài)電荷轉(zhuǎn)移至多巴胺醌進(jìn)而引起N-CDs熒光猝滅。N-CDs的合成方案及熒光猝滅原理見(jiàn)圖6。

圖6 N-CDs的合成方案及熒光猝滅原理Fig.6 Scheme of the synthetic strategy for the N-CDs and the principle of fluorescence quenching

圖7 N-CDs對(duì)DA的選擇性Fig.7 Selectivity of N-CDs to DA

圖8 N-CDs熒光強(qiáng)度隨DA濃度的變化Fig.8 Fluorescence intensity of N-CDs under diffirent DA concentrations

2.6 氮摻雜碳點(diǎn)對(duì)DA的選擇性

2.7 N-CDs對(duì)DA的檢測(cè)

考察了B-R緩沖溶液(pH 8.0)中不同濃度的DA 對(duì)N-CDs 熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖8所示。在0～100 μmol/L范圍內(nèi)，隨著DA濃度的增大 ，N-CDs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，發(fā)生不同程度的熒光猝滅，當(dāng)DA濃度為100 μmol/L時(shí),其熒光猝滅率超過(guò)50%；在2.5～37.5 μmol/L范圍內(nèi)，DA濃度與N-CDs 的熒光猝滅效率(IF/IF0)呈線性關(guān)系，線性方程為IF/IF0=-0.008 1cDA+0.936 1，r2=0.993 2，檢出限(3σ/k)為0.08 μmol/L。

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

為進(jìn)一步研究方法的實(shí)用性，實(shí)驗(yàn)取志愿者尿液用B-R緩沖液( pH 8.0)稀釋5倍，取稀釋后的尿液2.0 mL，按DA測(cè)定方法[29]進(jìn)行多巴胺的回收率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，其加標(biāo)回收率為99.5%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%～2.3%。測(cè)定結(jié)果的方法回收率和RSD均在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明此方法準(zhǔn)確度高，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析。

2.9 與其他方法的比較

將本方法的檢測(cè)結(jié)果與其他文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，本方法的檢測(cè)性能與文獻(xiàn)報(bào)道的比色分析法、電化學(xué)分析法和熒光光度法相當(dāng)，具有線性范圍寬、檢出限較低等優(yōu)點(diǎn)。

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Results of recovery test(n=6)

表2 與其他多巴胺檢測(cè)方法的對(duì)比Table 2 Comparison with other methods for determination of dopamine

3 結(jié) 論

以檸檬酸為碳源，尿素為氮源，采用微波一步法合成了水溶性好，富含—OH、—COOH和—NH2等官能團(tuán)的氮摻雜碳點(diǎn)，所制備的N-CDs對(duì)溶液中的DA具有良好的選擇性、靈敏性和抗干擾能力，基于此建立了一種新的、快速檢測(cè)DA的方法。該方法的檢出限達(dá)0.08 μmol·L-1。應(yīng)用于實(shí)際樣品尿液中DA含量的檢測(cè)，其加標(biāo)回收率為99.5%～106%，RSD為1.8%～2.3%。該方法靈敏，簡(jiǎn)單，易操作，在實(shí)際生物樣品中DA含量的檢測(cè)方面具有一定的應(yīng)用前景。