戴彩霞，何 榮

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023)

油菜是我國(guó)主要的油料作物之一，每年榨油產(chǎn)生的副產(chǎn)物菜籽粕約600萬t，菜籽粕中蛋白質(zhì)含量達(dá)35%～40%[1]，極具開發(fā)價(jià)值。菜籽蛋白具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，沒有限制性氨基酸，氨基酸的組成也非常合理，尤其是含有足夠的堿性氨基酸(賴氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸、半胱氨酸)[2]，基本符合FAO與WHO的推薦模式。由于菜籽蛋白極好的氨基酸平衡組成和高生物利用度，菜籽蛋白被認(rèn)為是飲食蛋白質(zhì)的合適來源[3]。

和很多植物蛋白一樣，菜籽蛋白的溶解性較差[4]，在很大程度上限制了其應(yīng)用。現(xiàn)代技術(shù)采用多種方法可以提高蛋白質(zhì)的利用率。通過化學(xué)改性[5]制備水凝膠，提高蛋白質(zhì)的溶解性和組織親和性，可以應(yīng)用于藥物傳遞和組織修復(fù)工程。Zhang等[6]采用酶解的方法，改善了菜籽蛋白的溶解性，制備了機(jī)械性能良好的可食性菜籽蛋白水解物復(fù)合膜，可用作食品包裝材料。Ji等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與水浴加熱相比，微波處理的魚糜蛋白質(zhì)-多糖凝膠的結(jié)構(gòu)更加緊密穩(wěn)定，持水性更好，對(duì)于魚產(chǎn)品加工具有指導(dǎo)意義。因此，可以采用化學(xué)、物理或酶處理的方式來改善蛋白質(zhì)的性質(zhì)，以期達(dá)到動(dòng)植物蛋白的多元化應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)的目的是研究超高壓處理和加熱處理對(duì)菜籽蛋白功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)變化的影響，從而為菜籽蛋白的合理加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

菜籽粕，中糧東海油脂工業(yè)有限公司；菜籽油，市售；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)等，分析純，F(xiàn)isher公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

4-1 HP高壓反應(yīng)系統(tǒng)，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；J-26 XP高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司；IKA磁力攪拌器，德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司；HH-2數(shù)顯水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；FE 20K pH計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO公司；ZS-90納米激光粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；JASCOJ-815型分光偏振計(jì)，日本JASCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽分離蛋白的制備

根據(jù)Wang等[8]的方法從菜籽粕中提取菜籽分離蛋白(RPI)。將菜籽粕溶于蒸餾水(質(zhì)量體積比1∶10)中，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0，室溫?cái)嚢? h，然后在4℃、10 000 r/min下離心20 min。 收集上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 4.5，靜置，離心(10 000 r/min，30 min)。用乙醇(除去多酚組分)洗滌沉淀兩次，然后在蒸餾水中透析沉淀，在4℃下每2 h更換蒸餾水，24 h后取出沉淀并冷凍干燥以獲得RPI。

1.2.2 菜籽蛋白的超高壓處理和加熱處理

用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)制備1%的菜籽分離蛋白懸濁液，置于4℃條件下攪拌12 h。將懸濁液密封在聚乙烯袋中，然后放入可以調(diào)節(jié)溫度與壓力的高壓裝置中。在保持25℃條件下，調(diào)節(jié)壓力為200、400、600 MPa，分別處理15 min。同樣地，將懸濁液分別在60、80、100℃條件下水浴加熱15 min。然后取出，冰水冷卻后冷凍干燥，-20℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.3 溶解性的測(cè)定

將不同加熱處理與超高壓處理的菜籽分離蛋白制備成溶液，用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH分別為3、4、5、6、7、8和9，攪拌30 min使樣品混勻，靜置2 min后，將上層液倒入離心管中離心(5 000 r/min, 20 min)。取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。同時(shí)以不作處理的菜籽分離蛋白作為對(duì)照組進(jìn)行處理，下文同理。溶解度按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算。

(1)

1.2.4 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Malomo等[10]的方法制備乳液。在pH 3、5、7、9的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液中分別制備10、25、50 mg/mL的菜籽蛋白溶液，然后加入25%的菜籽油，將混合液以12 000 r/min高速剪切2 min，立即測(cè)定乳液油滴粒徑。靜置30 min后，測(cè)油滴粒徑。乳化穩(wěn)定性按照公式(2)計(jì)算。

(2)

1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

配制pH分別為3、5、7和9，濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并用這些緩沖液分別制備質(zhì)量濃度為5、12.5、25 mg/mL的菜籽蛋白懸液，以10 000 r/min均質(zhì)2 min，將均質(zhì)后的樣品迅速轉(zhuǎn)移到一個(gè)刻度量筒中，讀取泡沫體積和蛋白溶液總體積，靜置30 min后讀取泡沫體積，并按照下式計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

(3)

(4)

1.2.6 持水性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品分散于10 mL蒸餾水中，以300 r/min攪拌1 h后，以4 000 r/min離心20 min，去掉上清液，稱重，并按照公式(5)計(jì)算持水力。

(5)

1.2.7 持油性的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.5 g蛋白樣品于10 mL菜籽油中并旋渦振蕩混合均勻，以300 r/min攪拌1 h后，以4 000 r/min離心20 min，去掉油層，稱重，并按照公式(6)計(jì)算持油力。

(6)

1.2.8 圓二色譜的測(cè)定

配制pH分別為3、5和9，濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并用這些緩沖液配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液。使用JASCOJ-815型分光偏振計(jì)測(cè)定圓二色譜。測(cè)定條件：掃描范圍180～240 nm，光程0.1 cm，以100 nm/min速率計(jì)算橢圓率，分辨率0.2 nm，記錄的光譜各自是減去緩沖光譜后的3次掃描的平均值。圓二色譜用平均橢圓率表示，單位為deg·cm2/dmol。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析Duncan多重比較，以P<0.05為有顯著差異。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性

溶解性是蛋白質(zhì)最重要和最基本的性質(zhì)，因?yàn)槠溆绊懼鞍踪|(zhì)的乳化性、起泡性、持水性和持油性等性質(zhì)。圖1是不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性。

圖1 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的溶解性曲線

由圖1可知，在pH大于4時(shí)，各條件下(除100℃加熱處理和對(duì)照組外)的菜籽蛋白的溶解性均隨pH的升高而迅速上升，100℃加熱處理的菜籽蛋白的溶解性隨pH的升高先降低，pH大于7時(shí)又緩緩升高。這是由于pH 4接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)溶解性降低[11]，同時(shí)過高的溫度使蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，改變蛋白質(zhì)分子之間相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，溶解性降低。菜籽蛋白在堿性條件下具有較高的溶解性，故溶解性隨pH的增加而略有升高。超高壓處理?xiàng)l件下，600 MPa處理的菜籽蛋白的溶解性最好，當(dāng)pH為9時(shí)溶解度達(dá)到71.23%；加熱處理?xiàng)l件下，80℃加熱處理的菜籽蛋白溶解性最好。

2.2 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑和乳化穩(wěn)定性

聚集和絮凝等變化對(duì)粒徑影響較大[12]。圖2為不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑。

注：1.對(duì)照組； 2.200 MPa； 3.400 MPa； 4.600 MPa； 5.60℃； 6.80℃； 7.100℃。下同。圖2 不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳液粒徑

由圖2可知，pH 3時(shí)，相比對(duì)照組，超高壓處理使乳液粒徑增大，加熱處理則在80℃、質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)乳液粒徑最小，為0.23 μm。pH 5時(shí)，接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)溶解性差，只在質(zhì)量濃度10 mg/mL時(shí)，相比對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組乳液粒徑減小顯著(P<0.05)。pH為7和9時(shí)，超高壓和加熱處理對(duì)乳液粒徑的增大有一定的促進(jìn)作用?？傮w趨勢(shì)是蛋白質(zhì)量濃度越大，乳液粒徑(除pH 3時(shí)80℃和100℃加熱處理的蛋白樣品、pH 5和pH 7時(shí)100℃加熱處理的蛋白樣品)越小，酸性條件對(duì)乳液粒徑影響較大，堿性條件影響較小。

不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳化穩(wěn)定性如圖3所示。

圖3 不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的乳化穩(wěn)定性

由圖3可知：pH 3～9條件下，超高壓處理的菜籽蛋白乳化穩(wěn)定性隨蛋白質(zhì)量濃度的升高而增大，加熱處理的蛋白樣品乳化穩(wěn)定性在pH 3和pH 5時(shí)，都是質(zhì)量濃度25 mg/mL的較差，在pH 7和pH 9時(shí)，乳化穩(wěn)定性均隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大而增大，且均高于同等條件下的(100℃加熱處理組除外)對(duì)照組。在酸性條件下，加熱處理的菜籽蛋白乳化穩(wěn)定性整體優(yōu)于超高壓處理的，在堿性條件下則相反。乳化性和乳化穩(wěn)定性與蛋白的親水、親油基團(tuán)的表面分布以及分子的柔順性有關(guān)。超高壓、加熱處理以及乳液的pH都會(huì)影響菜籽蛋白疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)和表面電荷分布的變化[13]，因此根據(jù)不同的要求適當(dāng)調(diào)整處理?xiàng)l件才能提高乳化穩(wěn)定性。

2.3 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性在焙烤和釀酒行業(yè)中有著重要的實(shí)際應(yīng)用。圖4為不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性。

由圖4可知，pH 7和pH 9的蛋白起泡性整體優(yōu)于pH 3和pH 5的，超高壓處理的蛋白起泡性整體高于加熱處理的。對(duì)于超高壓處理，壓力從200 MPa升到400 MPa，起泡性增強(qiáng)；繼續(xù)升至600 MPa時(shí)，起泡性減弱，但整體均優(yōu)于同等條件下的對(duì)照組。對(duì)于加熱處理，在pH 3和pH 5時(shí)，起泡性隨溫度升高先升高后降低，在pH 7和pH 9時(shí)，隨溫度升高起泡性降低(蛋白質(zhì)量濃度5 mg/mL除外)，但與對(duì)照組相比，加熱處理對(duì)起泡性的改善作用不大。整體而言，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度升高時(shí)，起泡性呈增強(qiáng)趨勢(shì)，在pH 7.0、400 MPa加壓處理、質(zhì)量濃度為25 mg/mL 的蛋白起泡性最好。適當(dāng)?shù)母邏汉图訜崽幚韺?dǎo)致蛋白質(zhì)分子解聚，疏水性增強(qiáng)，分子柔性增大，有利于起泡性提高，但隨溫度和壓力的升高，蛋白質(zhì)過度變性，蛋白質(zhì)聚集沉淀，起泡性減弱。

圖5為不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的泡沫穩(wěn)定性。由圖5可知，在pH 3～7的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，加熱處理樣品的泡沫穩(wěn)定性整體優(yōu)于超高壓處理樣品的。在pH為5和7時(shí)，加熱處理的質(zhì)量濃度為12.5、25 mg/mL的菜籽蛋白泡沫穩(wěn)定性與對(duì)照組和超高壓處理組差異不顯著(P> 0.05)。600 MPa處理的5 mg/mL蛋白樣品，在4種pH條件下均表現(xiàn)出最差的泡沫穩(wěn)定性。但整體來說，超高壓和加熱處理組泡沫穩(wěn)定性在一定程度上優(yōu)于對(duì)照組。分析認(rèn)為，經(jīng)超高壓和加熱處理的樣品，蛋白質(zhì)分子鏈充分延展，使疏水基團(tuán)充分暴露以及鏈段柔性增加，在空氣-水界面展開形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)和空氣結(jié)合的能力[14-15]，從而提高其泡沫穩(wěn)定性。

圖4 不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的起泡性

圖5 不同質(zhì)量濃度菜籽蛋白在不同pH條件下的泡沫穩(wěn)定性

2.4 超高壓和加熱處理對(duì)蛋白樣品持水性和持油性的影響

超高壓和加熱處理對(duì)菜籽蛋白持水性和持油性的影響分別如圖6、圖7所示。

持水性是指蛋白質(zhì)吸收和保持水分的能力，對(duì)蛋白質(zhì)在食品工業(yè)中應(yīng)用具有重要的意義。

圖6 不同處理菜籽蛋白的持水性

圖7 不同處理菜籽蛋白的持油性

由圖6可知，與對(duì)照組相比，200～400 MPa的超高壓處理對(duì)菜籽蛋白的持水性并無顯著性影響(P>0.05)，600 MPa的超高壓處理使菜籽蛋白持水性增加。而加熱處理對(duì)其持水性影響顯著，60、80、100℃處理的菜籽蛋白的持水力由對(duì)照組的1.50 g/g，分別升高到2.01、3.22、3.67 g/g。有研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理可以提高蛋白質(zhì)的持水率，并隨著壓力的增加而增大[16]，本研究中超高壓處理對(duì)持水性影響不大，這可能與蛋白質(zhì)種類有關(guān)，而熱處理改變了蛋白質(zhì)表面的帶電基團(tuán)和極性基團(tuán)，從而提高了對(duì)水的結(jié)合程度，使其持水性增強(qiáng)。

蛋白質(zhì)的持油性對(duì)于蛋白質(zhì)在保留風(fēng)味物質(zhì)和與油脂物質(zhì)結(jié)合過程中具有重要實(shí)際應(yīng)用。由圖7可知，超高壓和加熱處理都能顯著提高蛋白質(zhì)的持油性。對(duì)照組菜籽蛋白的持油力為2.21 g/g，經(jīng)過600 MPa超高壓處理和100℃加熱處理后可分別達(dá)到6.67、4.53 g/g，持油力分別提高了201.81%和104.98%。結(jié)合持水性來看，超高壓和加熱處理都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)極性基團(tuán)、疏水基團(tuán)暴露以及表面電荷重排，但超高壓促使更多疏水基團(tuán)暴露從而結(jié)合更多的油脂，而加熱使得極性基團(tuán)暴露，增加其親水性。

2.5 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的圓二色譜分析

超高壓和加熱處理對(duì)菜籽蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響可以通過圓二色譜進(jìn)行分析。圖8為不同處理菜籽蛋白在pH 3、5、9下的圓二色譜圖(pH 7條件下的已經(jīng)發(fā)表，具體見文獻(xiàn)[2]，在此不再分析)。

圖8 不同處理菜籽蛋白在不同pH條件下的圓二色譜圖

由圖8可知，不同pH的緩沖液對(duì)超高壓和加熱處理的蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不同。對(duì)照組在不同pH的緩沖液中較為穩(wěn)定，顯示在190 nm附近的正帶，在200 nm過零點(diǎn)，在208 nm附近有負(fù)帶。100℃處理的樣品在3種pH緩沖液中結(jié)構(gòu)變化都非常劇烈，橢圓率更趨近于0，說明二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸被破壞。80、60℃處理的蛋白樣品在pH 3和pH 5的緩沖液中變化趨勢(shì)相似，在202、222 nm處的橢圓率高于對(duì)照組，表明α-螺旋減少和β-折疊增加；pH 9時(shí)，樣品結(jié)構(gòu)變化較大，60℃處理組的α-螺旋含量比80℃處理組下降明顯。超高壓處理之后，在pH 3的緩沖液中，400、600 MPa處理組促使β-折疊增加，而200 MPa促使α-螺旋減少；在pH 5的緩沖液中，超高壓對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響較小，這與超高壓處理的β-乳球蛋白在pH 5的緩沖液中二級(jí)結(jié)構(gòu)變化劇烈正好相反[17]；在pH 9的緩沖液中，超高壓導(dǎo)致208 nm處的橢圓率減小，這說明α-螺旋增加，并且在400 MPa處理下具有最大值，與之前報(bào)道的300 MPa處理的大豆蛋白結(jié)果類似[18]。

3 結(jié) 論

研究了超高壓和加熱處理對(duì)菜籽蛋白溶解性、乳化性、起泡性、持水性、持油性以及結(jié)構(gòu)的影響。在pH大于7的條件下，與對(duì)照組相比，加熱處理使菜籽蛋白的溶解性下降，超高壓處理提高菜籽蛋白的溶解性。樣品蛋白質(zhì)量濃度越大，乳液粒徑整體越小，酸性條件比堿性條件對(duì)乳液粒徑影響大，超高壓和加熱處理可在一定程度上提高乳化穩(wěn)定性。超高壓處理對(duì)蛋白的起泡性有促進(jìn)作用，加熱處理對(duì)泡沫穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。與對(duì)照組相比，加熱和超高壓都能促進(jìn)持水、持油力，100℃加熱處理的菜籽蛋白持水力提高144.67%，600 MPa處理的菜籽蛋白持油力提高201.81%。圓二色譜分析得出不同pH條件下不同處理菜籽蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化差異大，100℃加熱處理對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響顯著(P<0.05)。研究認(rèn)為，超高壓和加熱處理都能改善菜籽蛋白的功能性質(zhì)，對(duì)于菜籽蛋白的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有實(shí)際意義。