陳斯楠，畢生雷，魯 龍，法 明，冉芳靜, 宋玉偉

(1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽 473000； 2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室，河南 南陽 473000)

隨著能源需求量的逐年上升，化石燃料逐漸呈現(xiàn)枯竭的趨勢，生物柴油的開發(fā)以及應(yīng)用引起了人們越來越多的關(guān)注。產(chǎn)油微生物自20世紀(jì)50年代以來一直是人們研究的熱點(diǎn)，主要由于其具有生長周期短，不需要大面積的生產(chǎn)用地，胞內(nèi)油脂含量高以及油脂品質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，可作為生物柴油的原料來源，因此成為替代化石能源，解決能源危機(jī)的一個(gè)十分有潛力的研究方向[1-2]。

圓紅冬孢酵母屬擔(dān)子菌門，胞內(nèi)油脂含量可達(dá)生物量的60%～70%。該菌種不但可以利用廉價(jià)的菊芋、秸稈替代葡萄糖作為原料，而且可以在酒精廢水中進(jìn)行發(fā)酵，不僅培養(yǎng)成本低廉，還具有一定的環(huán)保發(fā)展?jié)摿3-4]。但該菌種擁有較為堅(jiān)固的細(xì)胞壁，而且細(xì)胞壁上附著有大量的β-1,3-葡甘露聚糖，因此細(xì)胞破碎的難度相對較大，探究細(xì)胞破碎方法也就顯得格外重要[5]。目前，細(xì)胞的破碎方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物酶解法，物理球磨法作為一種高效的細(xì)胞破碎方法，操作簡便穩(wěn)定，設(shè)備價(jià)格較低，維護(hù)成本低廉，破碎率可控制，易放大，不影響油脂結(jié)構(gòu)，符合清潔能源生產(chǎn)理念，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模上已得到應(yīng)用，適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞[6-7]。因此，本文探究物理球磨法對圓紅冬孢酵母細(xì)胞的破碎效果，優(yōu)化細(xì)胞破碎工藝條件，以期為圓紅冬孢酵母油脂的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

圓紅冬孢酵母發(fā)酵液：河南天冠企業(yè)集團(tuán)試驗(yàn)中心提供，由圓紅冬孢酵母使用葡萄糖、蛋白胨等原料發(fā)酵所得，圓紅冬孢酵母由中科院大連化物所提供，發(fā)酵終點(diǎn)生物量為117 g/L、pH為6.3，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)100℃ 滅菌備用[8]。無水乙醇、正己烷，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DK-S28電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；烘箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；ME3002E電子天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；高速離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；BCD-215KCM海爾冰箱，青島海爾股份有限公司；行星式球磨機(jī)，長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司；硅酸鋯珠(65)，致磨(上海)新材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 圓紅冬孢酵母細(xì)胞的破碎

取30 mL發(fā)酵液，在7 000 r/min下離心5 min收集菌體，加入去離子水洗滌2次，于105℃烘至恒重。將烘干后的酵母干粉加水配制成150 g/L的溶液，每個(gè)球磨罐裝載300 mL的酵母液及適量的研磨介質(zhì)。由于對一定的細(xì)胞存在適宜的微珠粒徑，而酵母細(xì)胞的最佳破碎直徑為0.2～0.7 mm，因此本試驗(yàn)采用0.5 mm的介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)[9]。每個(gè)對稱位置的球磨罐的總質(zhì)量保證相等，隨后將罐體密封放入機(jī)器中卡緊，設(shè)定球磨機(jī)轉(zhuǎn)速、旋轉(zhuǎn)方向、研磨時(shí)間等參數(shù)。球磨罐通過高速轉(zhuǎn)動(dòng)，帶動(dòng)介質(zhì)在罐體中劇烈攪動(dòng)，球磨珠與細(xì)胞之間的碰撞力與剪切力作用于細(xì)胞壁，使得細(xì)胞壁破碎釋放油脂[10]。

1.2.2 油脂得率測定

在破碎后的酵母液中加入100 mL正己烷和30 mL無水乙醇，振蕩搖勻，在7 000 r/min下離心10 min，棄去殘?jiān)?，將上清液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，同樣的方法重復(fù)3次，將得到的上清液合并至分液漏斗中，取有機(jī)溶劑層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中以60℃、3 kPa的條件將有機(jī)溶劑與水去除[11-12]，得到油脂。按下式計(jì)算油脂得率。

油脂得率=旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的油脂質(zhì)量/酵母干粉質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 研磨介質(zhì)對破碎結(jié)果的影響

設(shè)置球磨機(jī)轉(zhuǎn)速為300 r/min，研磨時(shí)間為3 h，介質(zhì)添加量(以酵母液體積計(jì)，下同)為50%，采用不同介質(zhì)研磨，破碎結(jié)束后，提取分離油脂，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同研磨介質(zhì)對油脂得率的影響

由圖1可知，在相同條件下玻璃珠的效率最低，原因是玻璃珠的物理結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其容易破碎，在高轉(zhuǎn)速的球磨機(jī)中玻璃珠承受不住較高的離心力，在試驗(yàn)過程中玻璃珠碎珠的現(xiàn)象嚴(yán)重，不但影響破碎效率，并且對溶液造成污染。由于分離困難因此會(huì)對油脂品質(zhì)造成極大的影響，工業(yè)放大后這些缺點(diǎn)會(huì)更加突出，影響工藝的經(jīng)濟(jì)性。而鋼珠與硅酸鋯珠價(jià)格相仿，但硅酸鋯珠的效率較高，從經(jīng)濟(jì)和效率上來看工業(yè)生產(chǎn)選擇硅酸鋯珠作為介質(zhì)所帶來的經(jīng)濟(jì)效益會(huì)更高。因此，采用硅酸鋯珠作為研磨介質(zhì)。

2.1.2 研磨時(shí)間對破碎結(jié)果的影響

設(shè)置球磨機(jī)轉(zhuǎn)速為300 r/min，介質(zhì)添加量為50%，研磨時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，破碎結(jié)束后，提取分離油脂，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同研磨時(shí)間對油脂得率的影響

由圖2可知，2.5 h之前油脂得率與研磨時(shí)間大致呈線性增長關(guān)系，2.5 h后油脂得率增長明顯緩慢，說明此時(shí)的細(xì)胞已經(jīng)基本完成破碎。因此，選擇2.5 h作為最佳研磨時(shí)間。

2.1.3 球磨機(jī)轉(zhuǎn)速對破碎結(jié)果的影響

設(shè)置研磨時(shí)間為2.5 h，介質(zhì)添加量為50%，球磨機(jī)轉(zhuǎn)速分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500 r/min，破碎結(jié)束后，提取分離油脂，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同球磨機(jī)轉(zhuǎn)速對油脂得率的影響

由圖3可知，球磨機(jī)轉(zhuǎn)速在350 r/min以下時(shí)油脂得率與球磨機(jī)轉(zhuǎn)速大致呈線性增長關(guān)系，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到350 r/min時(shí)，油脂得率達(dá)到最大值，超過該轉(zhuǎn)速后，油脂得率有所下降。這是因?yàn)楫?dāng)球磨機(jī)轉(zhuǎn)速處于較低水平時(shí)，轉(zhuǎn)速越高對細(xì)胞的破碎作用越強(qiáng)，但是轉(zhuǎn)速過高時(shí)，由于離心力太大的緣故會(huì)使酵母細(xì)胞過于分散且研磨介質(zhì)離散運(yùn)動(dòng)的幅度會(huì)減小導(dǎo)致剪切力變小，從而降低破壁效果[13]。因此，選擇350 r/min作為最佳球磨機(jī)轉(zhuǎn)速。

2.1.4 介質(zhì)添加量對破碎結(jié)果的影響

設(shè)置研磨時(shí)間為2.5 h，球磨機(jī)轉(zhuǎn)速為350 r/min，介質(zhì)添加量分為10%、20%、30%、40%、50%、60%，破碎結(jié)束后，提取分離油脂，計(jì)算油脂得率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同介質(zhì)添加量對油脂得率的影響

由圖4可知，介質(zhì)添加量為40%時(shí)油脂得率最高。這是因?yàn)檫^多的介質(zhì)參與會(huì)導(dǎo)致罐體內(nèi)體積變小，介質(zhì)之間以及介質(zhì)與罐體的作用力會(huì)增加，反而降低了對細(xì)胞的剪切力[14]。因此，選取40%作為最佳介質(zhì)添加量。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際條件，選取硅酸鋯珠作為研磨介質(zhì)，應(yīng)用Design-Expert軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以研磨時(shí)間(X1)、球磨機(jī)轉(zhuǎn)速(X2)、介質(zhì)添加量(X3)為影響因素，油脂得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，分別進(jìn)行17組試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)，并對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表3。

表1 因素水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析及顯著性檢驗(yàn)

注： **表示差異極顯著(p<0.01)；*表示差異顯著(p<0.05)。

通過軟件計(jì)算可以得到響應(yīng)值在試驗(yàn)區(qū)中有一個(gè)穩(wěn)定的點(diǎn)(1.00，0.16，0.03)，實(shí)際值為研磨時(shí)間3 h、球磨機(jī)轉(zhuǎn)速358 r/min、介質(zhì)添加量40.3%。分析可知這是一個(gè)極大值點(diǎn)，從而確定該值即為本試驗(yàn)的最佳工藝參數(shù)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際情況將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為研磨時(shí)間3 h、球磨機(jī)轉(zhuǎn)速360 r/min、介質(zhì)添加量41%，經(jīng)過5次重復(fù)試驗(yàn)得到平均油脂得率為57.83%?；诔杀窘?jīng)濟(jì)性的考量，將研磨時(shí)間縮短至2.5 h，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證平均油脂得率為57.32%，縮短了17%的研磨時(shí)間并且對油脂得率的影響較小。因此，確定最佳工藝條件為研磨時(shí)間2.5 h、球磨機(jī)轉(zhuǎn)速360 r/min、介質(zhì)添加量41%。

3 結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)考察了研磨介質(zhì)、研磨時(shí)間、球磨機(jī)轉(zhuǎn)速、介質(zhì)添加量對圓紅冬孢酵母細(xì)胞壁破碎的影響，通過響應(yīng)面分析法，確定最佳的工藝條件為：研磨介質(zhì)為硅酸鋯珠，研磨時(shí)間2.5 h，球磨機(jī)轉(zhuǎn)速360 r/min，介質(zhì)添加量41%。在最佳條件下,油脂得率為57.32%。