戴 青，韓寧寧，趙 暉，楊秀玉

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

氯唑西林為半合成青霉素，耐酸耐青霉素酶，主要對耐藥金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的殺菌作用，能有效治療部分革蘭陰性菌、葡萄球菌和鏈球菌引起的感染。芐星氯唑西林是氯唑西林的二芐基乙二胺鹽，其制劑主要為芐星氯唑西林乳房注入劑，在獸醫(yī)應(yīng)用上主要用于治療敏感菌引起的奶牛干乳期乳房炎［1-2］。芐星氯唑西林以氯唑西林為主要活性成分，經(jīng)國家獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號數(shù)據(jù)查詢系統(tǒng)［3］查詢，我國獸藥生產(chǎn)企業(yè)中目前持有生產(chǎn)文號的芐星氯唑西林乳房注入劑生產(chǎn)企業(yè)有16家?！吨袊F藥典》2015年版一部收載了芐星氯唑西林與芐星氯唑西林乳房注入劑［4］。

《中國獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及到含量測定所需的氯唑西林對照品、二芐基乙二胺對照品和鑒別所需的芐星氯唑西林對照品三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。目前氯唑西林和二芐基乙二胺含量測定可溯源至中國食品藥品檢定研究院的對照品，而紅外鑒別所需的芐星氯唑西林對照品僅USP有供應(yīng)，但國外對照品價(jià)格昂貴，購買周期長。因此，擬研制芐星氯唑西林對照品，用于芐星氯唑西林及其制劑的紅外鑒別，對于獸藥生產(chǎn)企業(yè)芐星氯唑西林及制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀（Empower 3色譜工作站）；Waters 996二極管陣列檢測器（PDA），Mettler Toledo XS205 電子分析天平（精度0.01mg）；Nicolet FT-550 傅立葉紅外光度計(jì)；Metrohm 701 KF Titrino卡氏水分測定儀；HANNA Instruments HI9017酸度計(jì)。

1.2 試藥 芐星氯唑西林原料藥由鄲城巨鑫生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：201709001；氯唑西林對照品（批號：130423-200903，含量 91.0%）、二芐基乙二胺對照品（批號：130638-201301，含量99.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芐星氯唑西林USP對照品批號：G1M102；乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相鑒別 采用2.6.1 與 2.6.2 項(xiàng)下的高效液相色譜條件，分別取兩項(xiàng)下的供試品溶液與對照品溶液進(jìn)樣，采集色譜圖，考察供試品溶液主峰與對照品溶液主峰保留時(shí)間是否一致，紫外光譜圖是否一致。結(jié)果見圖1～圖4，在氯唑西林含量測定項(xiàng)下的色譜圖中，芐星氯唑西林原料主峰與氯唑西林對照品溶液主峰保留時(shí)間一致，且純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)，二者紫外光譜圖匹配角度小于匹配閾值，可判定為相同物質(zhì)；在二芐基乙二胺含量測定項(xiàng)下的色譜圖中，芐星氯唑西林原料主峰與二芐基乙二胺對照品溶液主峰保留時(shí)間一致，且純度角度小于純度閾值，為單一物質(zhì)峰，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)，二者紫外光譜圖匹配角度小于匹配閾值，可判定為相同物質(zhì)。

圖1 氯唑西林對照品光譜指數(shù)圖Fig 1 The HPLC spectrum of cloxacillin reference

圖2 芐星氯唑西林原料氯唑西林光譜指數(shù)圖Fig 2 The HPLC spectrum of cloxacillin in benzathine cloxacillin raw material

圖3 二芐基乙二胺對照品光譜指數(shù)圖Fig 3 The HPLC spectrum of dibenzylethylenediamine reference

2.2 紅外光譜鑒別 采用溴化鉀壓片法進(jìn)行測定，采集4000～400 cm-1波段紅外光譜圖，考察芐星氯唑西林原料與芐星氯唑西林USP對照品的紅外光吸收圖譜是否一致。結(jié)果見圖5～圖6，芐星氯唑西林原料的紅外光吸收圖譜與USP對照品的圖譜一致。

2.3 酸度測定 取芐星氯唑西林原料0.1 g，加水10 mL制成懸浮液，用苯二甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液和磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器后測定pH值。結(jié)果測得pH 值為 5.1。

圖4 芐星氯唑西林原料二芐基乙二胺光譜指數(shù)圖Fig 4 The HPLC spectrum of dibenzylethylenediamine in benzathine cloxacillin raw material

圖5 芐星氯唑西林USP對照品紅外光譜圖Fig 5 The IR spectrum of benzathine cloxacillin USP reference

2.4 水分測定 取芐星氯唑西林原料，用卡爾·費(fèi)休法測定其水分含量。結(jié)果測得水分為3.6%。

2.5 含量均勻性評價(jià) 采用2.6.1項(xiàng)下的高效液相色譜條件及測定法對本批芐星氯唑西林原料進(jìn)行了氯唑西林含量均勻性測試，并采用單因子方差分析法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。將樣品等分成10份，每份取樣2次進(jìn)行測定，樣品間自由度為9，樣品內(nèi)自由度為10，在約定的自由度水平α＝0.05的顯著水平下，計(jì)算臨界值 F0.05（9、10），計(jì)算結(jié)果與查表得到的 F 臨界值 F0.05（9、10） ＝3.02 比較，若計(jì)算值小于3.02，則表明在α＝0.05的顯著水平下，樣品含量是均勻的。結(jié)果見表1～表2，其統(tǒng)計(jì)量F為2.00，小于 3.02，表明本批原料均勻性良好，符合國家對照品研制的要求。

圖6 芐星氯唑西林原料紅外光譜圖Fig 6 The IR spectrum of benzathine cloxacillin raw material

表1 芐星氯唑西林原料氯唑西林含量均勻性結(jié)果Tab 1 The content homogeneity results of cloxacillin

表2 芐星氯唑西林原料均勻性的單因素方差分析結(jié)果Tab 2 Result of one-way analysis of variance for content homogeneity

2.6 含量測定 《獸藥標(biāo)準(zhǔn)品、對照品、對照藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［5］中關(guān)于化學(xué)對照品的基本技術(shù)要求中規(guī)定供檢查用的對照品原料，一般純度不低于90.0%。而《中國獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及到氯唑西林和二芐基乙二胺兩種物質(zhì)的測定，采用的是兩種液相色譜條件，目前沒有建立用同一色譜系統(tǒng)同時(shí)測定這兩種物質(zhì)的方法，也無其有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)研究方法，因此擬分別采用氯唑西林和二芐基乙二胺的含量測定液相色譜條件對原料進(jìn)行測定，確認(rèn)二者符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定即認(rèn)為該原料符合使用要求。

2.6.1 氯唑西林

2.6.1.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以 0.1 mol／L磷酸二氫鈉溶液 -乙腈（3∶1），用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至4.6±0.2為流動相；檢測波長220 nm；柱溫40℃。

2.6.1.2 測定法 取本品適量，精密稱定，加稀釋液（取磷酸二氫鈉3.15 g，加水450 mL使溶解，加乙腈300 mL混勻，用磷酸或1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4）溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含氯唑西林0.1 mg的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氯唑西林對照品適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中氯唑西林的含量。

2.6.1.3 結(jié)果 兩名檢驗(yàn)員各進(jìn)樣5份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次。取兩人的合并計(jì)算值，結(jié)果見表3，色譜圖見圖1～圖2。

表3 芐星氯唑西林原料氯唑西林含量測定結(jié)果Tab 3 The content determination results of cloxacillin

二者加權(quán)平均值為69.45%，按無水物計(jì)算，氯唑西林含量為72.1%。

2.6.2 二芐基乙二胺

2.6.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（端基封尾）；以0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.1）-乙腈（87∶13）為流動相；檢測波長為220 nm。

2.6.2.2 測定法 取本品約 0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加稀釋液（取磷酸二氫鈉3.15 g，加水450 mL使溶解，加乙腈300 mL混勻，用磷酸或1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.4）適量，超聲溶解，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，取10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖；另取二芐基乙二胺對照品適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中二芐基乙二胺的含量。

2.6.2.3 結(jié)果 由一人進(jìn)行測定，樣品平行制備2份，每份重復(fù)進(jìn)樣2次，以4次的平均值作為測定值，結(jié)果見表4，色譜圖見圖3～圖4。

表4 芐星氯唑西林原料二芐基乙二胺含量測定結(jié)果Tab 4 The content determination results of dibenzylethylenediamine

按無水物計(jì)算，二芐基乙二胺含量為20.0%。

綜上結(jié)果，按無水物計(jì)算，氯唑西林含量為72.1%，二芐基乙二胺含量為20.0%，二者含量之和為92.1%，符合《中國獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

3 討論與結(jié)論

3.1 質(zhì)量控制 由于《中國獸藥典》2015年版一部芐星氯唑西林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用的是兩種液相色譜條件分別對其中的氯唑西林和二芐基乙二胺進(jìn)行含量測定，并分別報(bào)告二者的含量，目前沒有建立用同一色譜系統(tǒng)同時(shí)測定這兩種物質(zhì)的方法，也無其有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)研究方法，因此本研究中以二者的含量作為主要質(zhì)量控制指標(biāo)。本研究建立的芐星氯唑西林國家對照品主要供芐星氯唑西林及其制劑紅外鑒別用，而要想獲得優(yōu)質(zhì)的紅外光譜，需除去樣品中的水分［6］，因此在考察本對照品原料是否符合要求時(shí)均按照無水物來計(jì)算。

3.2 穩(wěn)定性監(jiān)測 藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重要的基本性質(zhì)之一，用來描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時(shí)間變化情況，對照品使用中需要特別注意穩(wěn)定性問題。長期穩(wěn)定性是在規(guī)定的貯存條件下，在較長周期內(nèi)定期地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值的穩(wěn)定性評估，考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力［7-8］。根據(jù)獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范要求，今后將對芐星氯唑西林對照品進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察，第一次考察時(shí)間為一年后，以后每年定期測定一次。原則上對氯唑西林及二芐基乙二胺含量進(jìn)行考察，由一人進(jìn)行測定，每次測定平行樣不少于兩份，按無水物計(jì)算，氯唑西林與二芐基乙二胺含量應(yīng)符合規(guī)定。