孫巨勇，李偉，牟娜，牟佳，張長庚

[1.衡水市人民醫(yī)院（哈勵遜國際和平醫(yī)院） 檢驗科，河北 衡水 053000；2.衡水市婦幼保健院 檢驗科，河北 衡水 053000]

原發(fā)性肝細胞癌（以下簡稱肝癌）是一種常見的惡性腫瘤，約占我國癌癥發(fā)病總數(shù)的12%，分別是男性、女性癌癥發(fā)病順位的第2和5位[1]。肝癌的發(fā)生和發(fā)展受多種基因的調(diào)控，其中抑癌基因能抑制細胞增殖，對細胞的發(fā)育、分化、凋亡密切相關(guān)。當抑癌基因被抑制、突變、丟失或異常表達時會導致腫瘤細胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，纖連蛋白（Fibronectin,FN）基因和第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN）是兩種重要的抑癌基因，近年來臨床發(fā)現(xiàn)這2個基因在多種惡性腫瘤中表達異常[2]。有文獻報道FN與PTEN的異常表達會促進肝癌的轉(zhuǎn)移，這有可能與其對肝癌細胞微環(huán)境的影響有關(guān)[3]。盡管放化療等綜合治療在臨床取得了一定的進展，但是復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移仍是導致肝癌患者死亡的主要原因。目前關(guān)于FN和PTEN對肝癌的診斷和預(yù)后評估的研究較少，本研究旨在探討FN和PTEN的表達，以及對肝癌的診斷和預(yù)后的評估作用，為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取2013年1月—2015年10月衡水市人民醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的256例肝癌組織及癌旁組織。其中，男性139例，女性117例；年齡28～73歲，平均（57.11±5.73）歲。正常肝臟組織標本來源于同期的50例非癌癥患者。其中，因良性病變切除的遠離病灶的正常肝組織46例，肝外傷手術(shù)切除標本4例；男性32例，女性18例；年齡26～72歲，平均（56.28±5.42）歲。兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.1 納入標準①肝癌患者符合臨床診斷標準[4]，經(jīng)病理學檢測確診為肝癌，為原發(fā)性肝癌；②肝癌患者術(shù)前未接受過放療、化療；③非肝癌患者經(jīng)活檢或術(shù)后病理檢查確認為正常肝組織；④非肝癌患者血清HBsAg均為陰性；⑤已獲得患者及家屬知情同意。

1.1.2 排除標準①排除合并伴有除肝癌外其他腫瘤的患者；②排除伴有全身免疫性疾病患者；③排除合并伴有嚴重心臟、腎臟疾病功及能障礙的患者；④排除病理資料不完整的患者。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測 mRNA 的表達 肝組織標本離體后迅速保存于液氮中，F(xiàn)N和PTEN mRNA的表達采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測，使用Trizol（購自美國Invitrogen公司）從肝臟勻漿組織中提取總RNA，引物FN正向：5'-TGACTCGCTTTG ACTTCACCAC-3'，反向：5'-TCTCCTTCCTCGCTCAGTT CGT-3'；PTEN 正向：5'-ACACGACGGGAAGACAAG TT-3'，反向 ：5'-TCCTCTGGTCCTGGTATGAAG-3'。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PC試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，抗FN和PTEN兔緣多克隆抗體和SP試劑盒購自福州邁新生物科技。逆轉(zhuǎn)錄操作嚴格按照說明書進行，設(shè)立3個復(fù)孔，計算FN、PTEN和β-actin的特異性條帶在302 nm下的吸光度值，計算FN和PTEN與β-actin的比值作為mRNA的相對表達量。

1.2.2 Westernblotting 檢測蛋白表達 首先提取肝組織標本的總蛋白，采用Bradford比色法測定蛋白濃度；分別加入相同質(zhì)量的細胞裂解液和等體積的2×電泳加樣緩沖液，沸水浴水浴3 min；然后進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1 h（室溫），加入一抗，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次；再加入二抗，37℃孵育45 min，TBST緩沖液洗滌3次；壓片，顯影，采用Image plus 5.0分析顯影灰度。根據(jù)定性標準，蛋白表達分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）、強陽性（+++），陽性率=（弱陽性+陽性+強陽性）/總例數(shù)×100%。

1.2.3 聯(lián)合檢測采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線確定FN、PTEN mRNA診斷的臨界值，以FN mRNA表達、FN蛋白表達中任一為陽性，且同時PTEN mRNA表達、PTEN蛋白表達中任一為陰性，判定為聯(lián)合檢測肝癌陽性。

1.2.4 術(shù)后隨訪對 156 例肝癌患者術(shù)后進行 24 個月隨訪，每3個月進行1次隨訪。統(tǒng)計156例肝癌患者的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和生存率。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間的比較用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗； 計數(shù)資料用例數(shù)表示，采用χ2檢驗；繪制ROC曲線判斷單項檢測和聯(lián)合檢測的診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FN與PTEN mRNA的表達比較

3組FN與PTEN mRNA的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肝癌組織 FN mRNA表達高于正常組織，肝癌組織PTEN mRNA低于正常組織。見表1。

2.2 FN與PTEN蛋白的表達比較

3組FN與PTEN蛋白的表達陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=66.432和10.661，均P=0.000）；肝癌組織FN、PTEN陽性率高于正常組織。見表2和圖1～3。

2.3 單項檢測與聯(lián)合檢測的診斷效能比較

以FN mRNA表達、FN蛋白表達、PTEN mRNA表達和PETN蛋白表達作為檢驗變量，有無肝癌為狀態(tài)標量，以1-特異性為X軸，以敏感性為Y軸繪制ROC曲線（見圖4）。根據(jù)ROC曲線，F(xiàn)N mRNA診斷的臨界值為1.27，敏感性為74.22%，特異性為86.00%，ROC曲線下面積為0.794（95% CI：0.735，0.853）；FN蛋白表達敏感性為76.92%，特異性為88.00%，ROC曲線下面積為 0.808（95% CI：0.750，0.866）；PTEN mRNA表達診斷臨界值為1.44，敏感性為72.65%，特異性為 90.00%，ROC曲線下面積為 0.757（95% CI：0.677，0.837）；PETN蛋白表達單獨診斷敏感性為75.00%，特異性為100%，ROC曲線下面積為0.798（95% CI：0.728，0.869）。在最佳臨界值時，平行聯(lián)合檢測敏感性為86.72%，特異性為82.00%，ROC曲線下面積為0.912（95% CI：0.867，0.957）。聯(lián)合檢測敏感性高于各指標單獨檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且聯(lián)合診斷的AUC高于各項指標單獨檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并保持一定的特異性。聯(lián)合診斷時，當任一指標為陽性即可確診肝癌。見表3。

表1 FN與PTEN mRNA表達的比較 （±s）

表1 FN與PTEN mRNA表達的比較 （±s）

注：1）與癌旁組織比較，P ＜0.05；2）與正常肝組織比較，P ＜0.05；3）與正常肝組織比較，P ＜0.05

組別 n FN mRNA PTEN mRNA肝癌組織 256 1.51±0.531）2） 0.76±0.211）2）癌旁組織 256 1.13±0.373） 1.08±0.263）正常肝組織 50 0.69±0.16 1.47±0.52 F值 17.441 8.844 P值 0.000 0.000

2.4 聯(lián)合檢測與預(yù)后的關(guān)系

256例肝癌患者中有222例被聯(lián)合檢測診斷為陽性，34例診斷為陰性，聯(lián)合診斷為陽性的患者在術(shù)后12和24個月的復(fù)發(fā)率高于聯(lián)合診斷為陰性的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），生存率低于陰性患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合檢測陽性患者在術(shù)后6、12和24個月的轉(zhuǎn)移率高于聯(lián)合診斷為陰性的患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表2 FN與PTEN蛋白表達比較 （±s）

表2 FN與PTEN蛋白表達比較 （±s）

組別 n FN蛋白/例 陽性率/%PTEN蛋白/例 陽性率/%陰性 弱陽性 陽性 強陽性 陰性 弱陽性 陽性 強陽性肝癌組織 256 61 55 82 58 76.17 192 42 14 8 25.00癌旁組織 256 120 42 64 30 53.13 152 68 25 11 40.65正常肝組織 50 44 5 1 0 12.00 0 4 7 39 100.00

圖1 FN和PTEN蛋白在不同組織中的表達

圖2 FN蛋白在不同組織中的染色結(jié)果 （×400）

圖3 PTEN蛋白在不同組織中的染色結(jié)果 （×400）

圖4 聯(lián)合檢測和單項檢測診斷ROC曲線圖

表3 單項檢測和聯(lián)合檢測ROC曲線下面積比較

表4 聯(lián)合檢測與術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存的關(guān)系 例（%）

3 討論

原發(fā)性肝癌起病緩慢隱匿，早期難以察覺和診斷，惡性程度高，雖然目前各種化療、放療等綜合治療手段對臨床治療起到一定的作用，但肝癌的遠期療效仍然令人擔憂，病灶切除后仍然較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的遠期生存率，據(jù)報道我國肝癌5年的生存率不到20%[5]。因此提高臨床診斷率、盡早確診對治療肝癌有重要作用。肝癌發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，受許多因素影響，腫瘤細胞的黏附性和增殖能力是導致肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的兩個重要原因。抑癌基因是一類能抑制癌細胞生長繁殖的一類基因，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[6]。FN和PTEN是2種近年來研究較多的抑癌基因，已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)FN和PTEN的異常表達[7]，本研究旨在考察FN和PTEN在肝癌患者肝組織中的異常表達，探究其對肝癌的診斷作用以及對預(yù)后的評估價值。

FN是一種大型的糖蛋白，含糖量約在4.5%～9.5%，體內(nèi)多種細胞包括但不僅限于內(nèi)皮細胞、肌細胞、成纖維細胞等都可以合成FN，廣泛存在于細胞外基質(zhì)中。FN有眾多生理功能，可以連接細胞和細胞外基質(zhì)，介導黏附作用，促進細胞間的遷移、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[8]。FN的異常表達可以引起癌細胞黏附性降低，導致癌細胞受到的束縛降低，易于逃逸，侵襲性增強，腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[9]。還有研究報道FN能通過與整合素α結(jié)合調(diào)控腫瘤基因的表達，增強腫瘤細胞的抗凋亡作用，以此來提高腫瘤細胞的生命周期[10]。本研究通過比較肝癌組織和正常肝組織中FN mRNA和蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN mRNA和蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，與正常肝組織有差異，這與FN蛋白的作用理論相符合。

PTEN基因具有雙重特異性磷酸酶活性，是一種能使脂類發(fā)生去磷酸化的抑癌基因。目前認為PTEN主要是通過3’4’5-三磷酸肌醇相關(guān)通路調(diào)控細胞的生長和凋亡，具有促進細胞生長分化和促進細胞凋亡雙重作用[11]。其中促凋亡作用可以抑制腫瘤細胞的發(fā)展：PTEN可以通過抑制P13K/AKT通路的信號傳導，使細胞停滯在細胞周期的G1期，無法進入下一步分裂增殖，導致腫瘤細胞衰老和死亡[12]。PTEN基因的缺失或突變是導致腫瘤發(fā)生的一個重要原因，研究證實在肝癌患者中PTEN基因缺失的比例高達33%[13]。有學者在體外采用PTEN轉(zhuǎn)染肝癌細胞株，發(fā)現(xiàn)PTEN的表達能顯著降低FN基質(zhì)的遷移能力，與FN的表達呈負相關(guān)，其表達可以調(diào)控細胞的遷移活動，使肝癌細胞S期的數(shù)量下降，抑制肝癌細胞的生長速率[14]。本研究比較肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織中PTEN mRNA和蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中PTEN的表達低于正常肝組織，差異有統(tǒng)計學意義，這與上述文獻報道一致。

在此基礎(chǔ)上，本研究采用ROC曲線判定FN mRNA、FN蛋白、PTEN mRNA、PTEN蛋白單項檢測對肝癌的診斷效能，發(fā)現(xiàn)其曲線下面積分別為0.794、0.808、0.757和0.798，具有較好的診斷價值，敏感性分別為74.22%、76.92%、72.65%和75.00%。聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積為0.912，具有極高的診斷價值，敏感性為86.72%，高于單項檢測，特異性為82.00%，平行聯(lián)合檢測在提高敏感性的同時，保持了一定的特異性，可作為肝癌的臨床診斷參考指標。同時，筆者還研究聯(lián)合檢測結(jié)果與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷為陽性的肝癌患者的術(shù)后12、24個月的復(fù)發(fā)率高于聯(lián)合診斷為陰性的患者，而生存率低于陽性患者；聯(lián)合檢測陽性患者在術(shù)后6、12、24個月的轉(zhuǎn)移率高于聯(lián)合診斷為陰性的患者，提示FN和PTEN的表達可以作為預(yù)后的評估指標。吳金柱等[15]報道證實，F(xiàn)N和PTEN的表達可作為肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移、浸潤的危險因素。

本研究的局限性是僅限于來本院就診的患者，在廣度和深度上存在地域、人文等因素的差異，且研究時間比較短，未能完成所有患者術(shù)后5年的跟蹤，關(guān)于FN和PTEN與肝癌患者的遠期生存率的關(guān)系還有待進一步研究。FN和PTEN聯(lián)合檢測具有極高的診斷價值，可以作為肝癌診斷的臨床指標，同時其異常表達與預(yù)后密切相關(guān)，可以作為觀察評估預(yù)后的潛在指標。