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        載基因磁性脂質(zhì)微泡的制備及對(duì)人HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用研究*

        2019-08-22 08:49:14李華梅景香香劉元稅

        李華梅,景香香,劉元稅

        (海南省人民醫(yī)院,海南 ???570311)

        近年來(lái),隨著醫(yī)學(xué)分子影像學(xué)的發(fā)展,靶向超聲 微泡在超聲分子顯像及治療中的研究和應(yīng)用愈來(lái)愈受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。本研究在脂質(zhì)微泡中負(fù)載磁靶向納米粒子并攜帶基因,研制出一種新型的載基因磁性脂質(zhì)微泡,這樣既可以在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)基因的靶向高效定位釋放,又可以利用磁性粒子的磁感應(yīng)升溫特性對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熱療,為今后實(shí)現(xiàn)該磁性脂質(zhì)微泡用于腫瘤的聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑

        FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、PEI、DSPC、DPPE(美國(guó)Sigma公司),SF6氣體、吐溫80、甘油、丙二醇、pEGFP-C1(4.7 kb)、Fe3O4磁性納米粒子(海南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制備并儲(chǔ)存),PLXSN質(zhì)粒、Ecoli DH5Q和人肝癌細(xì)胞系HepG2(海南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存)。

        1.2 儀器

        能譜儀(Thermo NORAN,vantage,美國(guó)),機(jī)械振蕩儀(重慶影像研究所),SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備(深圳雙平高頻加熱器廠),掃描電鏡(日本JEOL JsM-6360LV),流式細(xì)胞儀(FACS vantage SE 型,美國(guó)Becton-Dickson制造),激光粒度分析儀(英國(guó)MALVERN公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 載基因磁性脂質(zhì)微泡的制備將 3 種有機(jī)磷脂按一定比例充分溶解于有機(jī)溶劑中,加熱30 min使有機(jī)溶劑蒸發(fā)完全,將葡萄糖和丙二醇按比例配置的水合液加入西林瓶中,超聲分散后使其形成脂質(zhì)懸液。在此懸液里先加入一定量的PEG4000和吐溫800.01 ml后,將一定量DNA/PEI/Fe3O4和明膠按比例加入到脂質(zhì)懸液中,用注射器充入定量的SF6氣體置換西林瓶上方的空氣。將西林瓶放入機(jī)械振蕩器中振蕩60 s,即得載基因磁性脂質(zhì)微泡。

        1.3.2 磁性脂質(zhì)微泡體外升溫實(shí)驗(yàn)以 PBS 溶液配制出Fe3O4濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5 g/L等4種磁性脂質(zhì)微泡溶液,各取5 ml入平底試管(20 mm)中,以20℃為起始溫度,置于輸出電流30 A、頻率230 kHz的SPG-06A高頻磁感應(yīng)加熱設(shè)備加熱1 h。每5 min測(cè)1次溫度,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、溫度為縱坐標(biāo)繪制磁性脂質(zhì)微泡的升溫曲線[1]。

        1.3.3 轉(zhuǎn)染效率的觀察轉(zhuǎn)染之前,預(yù)先將質(zhì)粒 DNA和PEI-Fe3O4分別用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋,然后按每孔中加入4 μg質(zhì)粒DNA的量,按照磁性納米粒子與質(zhì)粒DNA的比率(固定質(zhì)粒DNA的質(zhì)量)分別加入不同量的 PEI-Fe3O4(15 g/L),最后總體積為 400 μl。接著,將復(fù)合物置于室溫下孵育30 min,將此混合物加入脂質(zhì)原溶液中搖振,制備出載基因磁性脂質(zhì)微泡。將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,5×105個(gè)/孔細(xì)胞,孵育18 h后,用2 ml無(wú)血清1640培養(yǎng)基替換原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)基,其中含有按照不同比率配制的500 μl PEI-Fe3O4/pEGFP載基因磁性脂質(zhì)微泡(A組),置于強(qiáng)磁鐵上30 min,然后,用新鮮的含有血清的培養(yǎng)基替換無(wú)血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育24 h。以裸DNA(B組)和明場(chǎng)圖(C組)作為轉(zhuǎn)染的對(duì)照。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)情況。

        1.3.4 載基因磁性脂質(zhì)微泡基因治療聯(lián)合磁流體熱療對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖率,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞并吹打成細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104個(gè)/ml,按每孔100 ml接種于96孔板,每組5個(gè)接種復(fù)孔,接種細(xì)胞24 h后,隨機(jī)分為4組,1組加入1640培養(yǎng)液,2組加入磁性脂質(zhì)微泡,3、4組加入載基因磁性脂質(zhì)微泡,其中2、4組聯(lián)合MFH板置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h,給定輸出電流30 A,交變磁場(chǎng)為4 kW,兩板置于飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,每孔加入 MTT 20 pl,以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體,加入溶液150 μl DMSO/孔,搖勻10 min。讀取酶標(biāo)儀上493 nm處光密度(OD)值,取得細(xì)胞增殖率[2]。各組細(xì)胞存活率計(jì)算公式:實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值×100%)。

        流式細(xì)胞儀的測(cè)定,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液,將其濃度調(diào)整為3×105個(gè)/ml后接種于培養(yǎng)瓶。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組共接種4個(gè)培養(yǎng)瓶,24 h后按分組情況分別加入1640培養(yǎng)液(1組)、磁性脂質(zhì)微泡(2組)、載基因磁性脂質(zhì)微泡(3組)、載基因磁性脂質(zhì)微泡(4組),其中2、4組置于SP-04C高頻加熱器平板線圈上1 h,給定交變磁場(chǎng)4 kW,輸出電流30 h,4瓶細(xì)胞置于飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。檢測(cè)前將 PBS 洗滌 2 次的細(xì)胞重懸于 0.5 ml PI染色液(20 mg/ml,0.25 mg/ml RNase A)中于室溫下避光染色30 min,用目絲網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn)和χ2分割法,χ2分割法檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.0083,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 磁性脂質(zhì)微泡造影劑的表征

        所制磁性脂質(zhì)微泡掃描電鏡下似圓球形,平均粒徑為1 127 nm,分散度好(見(jiàn)圖1)。表面能譜分析示磁性脂質(zhì)微泡中P為脂質(zhì)成分,F(xiàn)e、O為磁性材料的成分(見(jiàn)圖2)[1]。

        圖1 磁性脂質(zhì)微泡掃描電鏡圖

        圖2 磁性脂質(zhì)微泡的能譜分析

        2.2 磁性脂質(zhì)微泡體外升溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        磁場(chǎng)強(qiáng)度恒定條件下,磁性脂質(zhì)微泡升溫能力與Fe3O4磁性納米粒子濃度呈正相關(guān),但有共同規(guī)律:前30 min升溫快速,30~ 50 min升溫平緩,50 min 后恒定于42~62℃(見(jiàn)圖3)。

        圖3 不同濃度Fe3O4磁性脂質(zhì)微泡磁感應(yīng)升溫曲線

        2.3 轉(zhuǎn)染效率

        pEGFP-C1/PEI/Fe3O4載基因磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖4)。

        圖4 熒光顯微鏡下HepG2轉(zhuǎn)染效率的觀察 (×200)

        2.4 載基因磁性脂質(zhì)微泡基因治療聯(lián)合磁流體熱療對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

        2.4.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組 HepG2 細(xì)胞相對(duì)增殖率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.481,P=0.001)。2、3、4組對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖均有抑制作用,且4組對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用高于2、3組。見(jiàn)圖5。

        圖5 載Wtp53基因磁性脂質(zhì)微泡對(duì)HepG2的生長(zhǎng)抑制作用

        2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果各組 HepG2 細(xì)胞經(jīng)處理48 h后,流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:2、3、4組在細(xì)胞周期G0期前細(xì)胞周期均被不同程度地阻滯在S或G/M期,且出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰。1組凋亡率為0.28%,2組凋亡率為16.13%,3組凋亡率為20.05%,4組凋亡率為42.93%,各組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.835,P=0.000),2組與3組凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0083),2組與4組、3組與4組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0083)。見(jiàn)圖6。

        圖6 載Wtp53基因磁性脂質(zhì)微泡處理細(xì)胞后的流式細(xì)胞圖

        3 討論

        超聲微泡經(jīng)歷了從普通微泡到靶向微泡的發(fā)展階段,現(xiàn)階段,在磁性脂質(zhì)微泡的表面進(jìn)行修飾[3]或在其內(nèi)部進(jìn)行負(fù)載,使其成為藥物和基因的靶向載體,制備出兼具靶向診斷和治療的磁性脂質(zhì)微泡成為研究熱點(diǎn)。

        超聲微泡用于包裹氣體的殼膜材料主要是體內(nèi)可生物降解的高分子多聚物[4-5]、脂質(zhì)[6]或白蛋白[7],為了便于微泡攜帶更多抗體和多肽等配體[8-9],可通過(guò)調(diào)節(jié)殼膜材料的脂質(zhì)配比或是適當(dāng)配比輔料來(lái)對(duì)微泡表面進(jìn)行修飾。超聲微泡的氣體核心多采用氟碳?xì)怏w(如C6F)或氟硫氣體(如SF6),其優(yōu)點(diǎn)為彌散度低、血液溶解度低。本室成膜材料選擇有機(jī)合成磷脂,膜內(nèi)填充SF6氣體,采用機(jī)械振蕩法制備磁性脂質(zhì)微泡,經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證,確定振蕩頻率為4 500 r/min,即可使微泡粒徑<2 μm,能經(jīng)血液循環(huán)順利到達(dá)病變部位,不易導(dǎo)致肺栓塞。

        超聲微泡不僅用于制備影像增強(qiáng)劑來(lái)提高圖像對(duì)比度,同時(shí)也可作為靶向基因載體來(lái)攜載基因。為了賦予普通微泡磁靶向性和磁感應(yīng)升溫特性且又可作為基因載體,筆者采用一定技術(shù)將進(jìn)行表面修飾的磁性納米粒與PLSN-53質(zhì)粒結(jié)合后混入脂質(zhì)原溶液中一起搖振,即制備出載基因磁性脂質(zhì)微泡。

        研究者將磁性脂質(zhì)微泡作為一種安全、便捷的載體[10-11],其表面或內(nèi)部攜載的基因或藥物能夠靶向釋放,從而達(dá)到治療疾病的目的。基因的有效轉(zhuǎn)染是基因治療成功的關(guān)鍵。HALLOW等[12]的研究表明,微泡作為一種空化核,在超聲輻照下可產(chǎn)生瞬時(shí)空化,升高局部組織和毛細(xì)血管細(xì)胞膜的通透性,促成聲孔形成。另外有學(xué)者研究亦表明[13],超聲作用微泡產(chǎn)生的空化效應(yīng)使其攜載的藥物和基因得到高效利用,達(dá)到良好的靶向治療效果。SAKAKIMA等[14]研究發(fā)現(xiàn),超聲輻射聯(lián)合磁性脂質(zhì)微泡轉(zhuǎn)染細(xì)胞可使轉(zhuǎn)染效率提高近6倍。LENTACKER等[15]制作的攜帶質(zhì)粒DNA微泡可提高人肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。QIU等[16]利用超聲輻照下,微泡聲空化效應(yīng)介導(dǎo)EGFP基因轉(zhuǎn)染兔肌腱,結(jié)果證實(shí)EGFP基因在兔肌腱中得到持續(xù)高表達(dá)。

        本研究創(chuàng)新性地將具有高熱穩(wěn)定性、良好的水溶性和較大的生物相容性的磁性納米粒子引入超聲微泡,旨在賦予普通微泡磁靶向性的同時(shí),使微泡對(duì)腫瘤組織兼具基因治療和磁感應(yīng)熱療[17]的特性。本實(shí)驗(yàn)交變磁場(chǎng)中包有磁性納米粒的脂質(zhì)微泡懸浮液溫度上升后穩(wěn)定在42~62℃,該區(qū)間溫度對(duì)腫瘤熱療具有良好效果。因此,可以利用不同濃度磁性脂質(zhì)微泡在一定磁場(chǎng)下的升溫恒溫來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的熱療[1]。

        本研究制備的磁性脂質(zhì)微泡不僅具有磁場(chǎng)的靶向性,同時(shí)可作為一種新型的磁流體和基因的載體,對(duì)腫瘤進(jìn)行磁感應(yīng)熱療和基因治療,有望成為靶向腫瘤治療的新途徑。

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