陳方方，白楊，王萍

（新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830011）

既往研究[1-2]顯示，Wnt信號(hào)通路涉及多種在胚胎發(fā)育過程中的分化事件，其可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)方面。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3]證明在17號(hào)染色體相關(guān)的家族性額顳癡呆兼有帕金森綜合征小鼠病程早期即有Wnt通路分子表達(dá)升高，而阿爾茨海默病（Alzheimer's disease,AD）患者腦組織中Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)及其在病理狀態(tài)下對(duì)海馬區(qū)突觸是否產(chǎn)生影響還未明了。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、海馬區(qū)突觸前蛋白（Synapsin1）及海馬區(qū)突觸后蛋白95（PSD-95）在AD病理狀態(tài)下的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康C57小鼠48只，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，均在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，設(shè)置光照周期，相對(duì)濕度（70±5）%，恒溫（25±2）℃。所有操作流程遵循醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的相關(guān)倫理規(guī)范。

1.2 試劑與儀器

試劑：蛋白Marker（美國(guó)Thermo公司），β-catenin、GSK-3β抗體（英國(guó)Abcam公司），Synapsin1、PSD-95抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司），RIPA裂解液、一抗稀釋液（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所），ECL發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）。儀器：Morris水迷宮儀器和分析軟件（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制），超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司），JEM-1200EX電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），電泳儀（中國(guó)北京六一儀器廠）。

1.3 分組方法

96只C57小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組48只。實(shí)驗(yàn)組為攜帶人淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloid precursor protein,APP）Swedish 突變（K595N/M596L）和PS1 deltaE9突變的C57小鼠，以鼠朊蛋白（mouse prion protein,PrP）基因?yàn)閱?dòng)子，即為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)組在3月齡出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)變化，5月齡出現(xiàn)老年斑，12月齡有大量老年斑形成。將實(shí)驗(yàn)組小鼠分為1、3、5及12月齡4組（對(duì)應(yīng)月齡處死），每組12只。對(duì)照組為正常C57小鼠，也分為1、3、5及12月齡4組，每組12只。小鼠1、3、5及12月齡分別相當(dāng)于人類年齡的20、30、50及60歲。

1.4 Morris水迷宮測(cè)試

Morris水迷宮主要用于在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)能力訓(xùn)練測(cè)試和記憶訓(xùn)練測(cè)試。各組小鼠處死前進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練3 d。記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期（評(píng)定小鼠的學(xué)習(xí)能力）。找平臺(tái)的最長(zhǎng)時(shí)間為60 s，若＞60 s小鼠仍沒有找到平臺(tái)，則將其引到平臺(tái)上，其潛伏期記為60 s。小鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，訓(xùn)練其對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力，撤去平臺(tái)后將小鼠從同一個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)驗(yàn)小鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶，記錄其第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間。所有數(shù)據(jù)的采集和處理通過Morris水迷宮自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

1.5 組織標(biāo)本病理形態(tài)學(xué)觀察

以10%水合氯醛麻醉小鼠后，采用頸椎離斷法處死小鼠，3 min內(nèi)快速獲取腦組織海馬標(biāo)本，經(jīng)冷凍切片（厚度8 μm）后，經(jīng)常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)病理變化。

1.6 Western blotting檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

按照蛋白提取試劑盒說明書提取腦組織蛋白，參照說明書以BCA法檢測(cè)各組蛋白濃度。以細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，緩沖液混合后98℃變性5 min；每組取蛋白 80 μg，12% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（恒流300 mA）后，轉(zhuǎn)移90 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫?fù)u床上封閉2 h，孵一抗（1∶800）4℃過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，封閉液稀釋二抗（1∶2 000）后，常溫下孵育 1 h。TBST洗滌3次，10 min/次，ECL發(fā)光試劑盒在曝光儀中進(jìn)行曝光，以內(nèi)參β-actin為對(duì)照，結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 Western blotting檢測(cè)海馬區(qū)突觸蛋白表達(dá)

同上操作提取腦組織蛋白，以BCA法檢測(cè)各組β-catenin、GSK-3β蛋白含量。以細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，緩沖液混合后98℃變性5 min；每組取蛋白 80 μg，12% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至 PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件為 Synaptophysin 200 mA，80 min；PSD-95 先 200 mA，80 min，再 300 mA，40 min；5%脫脂奶粉室溫?fù)u床上封閉2 h，用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，兔抗Synapsin 1∶400，PSD-95 1∶300孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次，封閉液稀釋二抗（1∶5 000）后，常溫下孵育 2 h。TBST 洗滌 3 次，10 min/次，ECL發(fā)光試劑盒在曝光儀中進(jìn)行曝光，以內(nèi)參β-actin為對(duì)照，結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，各組小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果、Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白及海馬區(qū)突觸蛋白表達(dá)水平采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），均逐漸延長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠逃避潛伏期較對(duì)照組同月齡小鼠延長(zhǎng)（t=2.496、3.746、7.209和12.287，P=0.021、0.001、0.000和0.000）；實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠首次跨越原平臺(tái)時(shí)間較對(duì)照組同月齡小鼠延長(zhǎng)（t=7.270、7.673、17.564 和 20.025，均P=0.000）；對(duì)照組1、3、5及12月齡小鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Morris 水迷宮測(cè)試結(jié)果比較 （n =12，s，±s）

表1 Morris 水迷宮測(cè)試結(jié)果比較 （n =12，s，±s）

注：?與對(duì)照組同月齡比較，P ＜0.05

組別 逃避潛伏期 首次跨越原平臺(tái)時(shí)間實(shí)驗(yàn)組1月齡 32.10±4.97? 22.09±2.89?3月齡 36.23±5.34? 26.32±3.41?5月齡 42.49±4.82? 33.56±2.27?12月齡 55.47±4.91? 40.27±3.20?F值 49.684 87.299 P值 0.000 0.000對(duì)照組1月齡 27.36±4.31 13.01±3.22 3月齡 28.23±5.12 13.31±3.02 5月齡 27.52±5.34 12.79±3.41 12月齡 28.08±5.96 14.11±3.20 F值 0.079 0.387 P值 0.971 0.763

2.2 小鼠病理形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組小鼠隨著月齡增加，細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小、間隙擴(kuò)大越明顯，顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞破壞越嚴(yán)重，錐體細(xì)胞樹突均變短。而對(duì)照組各月齡小鼠腦組織可見海馬區(qū)顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞呈整齊、緊密、多層規(guī)則排列；神經(jīng)元內(nèi)胞漿豐富，顆粒細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)較淺，核膜清楚，嗜堿性核仁清晰可見；錐體細(xì)胞樹突豐富，且向海馬伸展整齊。見圖1。

圖1 小鼠腦組織海馬染色病理圖（HE染色×400）

2.3 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），依次降低；實(shí)驗(yàn)組小鼠β-catenin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組同月齡小鼠降低（t=37.967、51.882、68.136和 124.881，均P=0.000）；實(shí)驗(yàn)組小鼠 GSK-3β蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組同月齡小鼠降低（t=7.076、0.772、12.847和 22.578，均P=0.000）；對(duì)照組 1、3、5及12月齡小鼠β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2和圖2。

表2 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n =12，±s）

表2 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n =12，±s）

注：?與對(duì)照組同月齡比較，P ＜0.05

組別 β-catenin GSK-3β實(shí)驗(yàn)組1月齡 1.36±0.02? 1.02±0.02?3月齡 1.12±0.02? 0.94±0.03?5月齡 0.80±0.01? 0.87±0.02?12月齡 0.51±0.01? 0.66±0.04?F值 81.297 346.545 P值 0.000 0.000對(duì)照組1月齡 1.67±0.02 1.13±0.05 3月齡 1.66±0.03 1.15±0.07 5月齡 1.68±0.04 1.14±0.07 12月齡 1.65±0.03 1.13±0.06 F值 2.105 0.277 P值 0.113 0.842

圖2 實(shí)驗(yàn)組小鼠Wnt信號(hào)通路β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)情況

2.4 海馬區(qū)突觸前后蛋白表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠Synapsin1及PSD-95表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），均依次降低；實(shí)驗(yàn)組Synapsin1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組同月齡小鼠降低（t=12.862、27.328、25.219和37.181，均P=0.000）；實(shí)驗(yàn)組小鼠PSD-95蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組同月齡小鼠降低（t=9.1917、18.371、31.870和34.170，均P=0.000）；而對(duì)照組1、3、5及12月齡小鼠Synapsin1、PSD-95蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖3。

表3 海馬區(qū)突觸前后蛋白表達(dá)水平比較（n =12，±s）

表3 海馬區(qū)突觸前后蛋白表達(dá)水平比較（n =12，±s）

注：?與對(duì)照組同月齡比較，P ＜0.05

images/BZ_10_1281_1232_2240_1870.pngimages/BZ_10_1281_2225_2240_2295.png1月齡 1.09±0.06 1.01±0.05 3月齡 1.11±0.05 1.00±0.04 5月齡 1.06±0.07 1.03±0.04 12月齡 1.07±0.06 1.03±0.06 F值 1.616 1.161

圖3 實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬區(qū)突觸前后蛋白表達(dá)情況

3 討論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能和記憶功能障礙，是中老年人群最常見的癡呆類型。AD的病因尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為與遺傳因素相關(guān)[4-5]。海馬是AD患者腦部受損最嚴(yán)重的部位，海馬神經(jīng)元變性及丟失直接導(dǎo)致其出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、記憶力障礙。因此，若能夠糾正AD患者海馬神經(jīng)元缺失將有望改善其臨床表現(xiàn)[6]。近年來臨床對(duì)內(nèi)源性海馬神經(jīng)前體細(xì)胞在AD中的作用進(jìn)行了有益的探索。研究表明[7]，AD早期海馬神經(jīng)元丟失的同時(shí)，伴有內(nèi)源性海馬前體細(xì)胞分裂、增殖，并分化為成熟的神經(jīng)元，遷移并參與修復(fù)受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，兩者處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。在疾病后期，由于誘導(dǎo)海馬前體細(xì)胞增殖分化的小生境的破壞，新生的海馬神經(jīng)元數(shù)量不斷減少，逐漸不能夠代償由于疾病導(dǎo)致的丟失神經(jīng)元的功能，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)行性進(jìn)展，并最終出現(xiàn)AD的一系列表現(xiàn)[8]。因此可以推測(cè)，AD患者體內(nèi)存在一種自我修復(fù)機(jī)制用以對(duì)抗疾病所導(dǎo)致的神經(jīng)變性過程，若能夠通過某種治療方法重建有利于海馬前體細(xì)胞增殖分化的小生境，誘導(dǎo)內(nèi)源性海馬神經(jīng)元的不斷產(chǎn)生和修復(fù)疾病導(dǎo)致的神經(jīng)變性過程，對(duì)AD的臨床將產(chǎn)生重要意義。

正常生理狀態(tài)下海馬前體細(xì)胞增殖和分化受到精確的調(diào)控，多種信號(hào)通路共同參與組成適合神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化的小生境。其中，Wnt信號(hào)通路在海馬神經(jīng)發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。Wnt基因是一組能夠編碼富含半胱氨酸的糖基化蛋白質(zhì)的基因，Wnt信號(hào)通路是生物進(jìn)化中極為保守的通路，包括經(jīng)典通路Wnt/β-catenin通路以及細(xì)胞極性通路和Wnt/Ca2+通路[9]。在Wnt/β-catenin經(jīng)典通路中，位于細(xì)胞外Wnt分子與細(xì)胞膜上Wnt蛋白特異性受體Frizzled蛋白和LRP5/6結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的Dvl蛋白，活化的Dvl蛋白能夠抑制摧毀復(fù)合體中的GSK-3β活性，從而使細(xì)胞漿內(nèi)游離的β-catenin避免被摧毀復(fù)合體磷酸化后降解，促使β-catenin在胞漿中聚集，并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移[10]。入核后的β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，繼而可產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育及出生后成體海馬神經(jīng)調(diào)控過程中，已有研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路在調(diào)控海馬的神經(jīng)發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，如早期ZHAO等[11]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎時(shí)期海馬區(qū)域特異性表達(dá)Frizzled-9（Wnt分子受體）主要分布在海馬的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒神經(jīng)元的樹突野和軸突中。INESTROSA等[12]研究表明，Wnt分子在成體腦海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層表達(dá)，在成體海馬星型膠質(zhì)細(xì)胞也有Wnt分子的表達(dá)，而成體海馬前體細(xì)胞則表達(dá)Wnt分子受體Frizzle-1等。此外，RíOS等[13]最新研究證實(shí)Wnt3a分子還參與出生后海馬神經(jīng)元突觸的重建。以上這些研究均提示，Wnt信號(hào)通路在出生后海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化過程中起著非常重要的作用。而近年來，國(guó)內(nèi)逐漸有報(bào)道證實(shí)Wnt信號(hào)通路參與精神疾病的發(fā)生、發(fā)展，如封文佳等[14]系統(tǒng)分析Wnt信號(hào)通路可通過胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控、核內(nèi)的調(diào)控影響精神分裂癥、AD及焦慮抑郁癥等的發(fā)生。王薇等[15]報(bào)道指出，Wnt信號(hào)通路在干細(xì)胞的增殖、分化及遷移等方面發(fā)揮著重要的作用，可通過干細(xì)胞的移植并激活其內(nèi)在的Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)新生海馬神經(jīng)元的產(chǎn)生，以彌補(bǔ)海馬神經(jīng)元的丟失來治療AD。霍江濤等[16]觀點(diǎn)亦與之類似，并認(rèn)為P53和Caspase-3均參與并影響Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組1、3、5及12月齡小鼠逃避潛伏期、首次跨越原平臺(tái)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，且均較對(duì)照組同月齡延長(zhǎng)，說明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能明顯受損。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠隨著月齡增加，其細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小、間隙擴(kuò)大越明顯，顆粒細(xì)胞及錐體細(xì)胞破壞現(xiàn)象越嚴(yán)重，錐體細(xì)胞樹突均變短，提示APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨著月齡增加，病理變化越嚴(yán)重。進(jìn)一步Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組 1、3、5及12月齡小鼠β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)水平依次降低，Synapsin1及PSD-95表達(dá)水平亦依次降低，且均較對(duì)照組同月齡小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，提示AD小鼠Wnt信號(hào)通路β-catenin、GSK-3β蛋白表達(dá)水平下降，可能是導(dǎo)致上述結(jié)果中小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能明顯受損，海馬區(qū)病理變化的重要原因，與姚宏波等[17]報(bào)道相符。該研究還認(rèn)為可通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響AD患者學(xué)習(xí)記憶相關(guān)酶及蛋白在海馬區(qū)的表達(dá)[17]。同時(shí)，突觸是相鄰神經(jīng)元間特化的連接區(qū)域，突觸可塑性與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)，決定突觸效能作用的影響因素不僅來源于突觸前（Synapsin1為突觸前蛋白），也可來自于突觸后（PSD-95為突觸后蛋白）[18]。本研究Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的下降可能與突觸前后蛋白表達(dá)水平下降相關(guān)，即Wnt信號(hào)通路的失活可能促進(jìn)AD病理過程，但Wnt信號(hào)通路對(duì)突觸前后蛋白表達(dá)的具體影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。