王海燕，劉 億，葛 巍，鹿秀云，李燕珍，劉端勇Δ，趙海梅Δ

(1. 江西中醫(yī)藥大學(xué),南昌 330004； 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,南昌 330006)

四神丸出自南宋·許叔微所撰寫的《普濟本事方》，由二神丸與五味子散組合而成，主治脾腎陽虛之腎泄[1]?，F(xiàn)代研究表明，能量代謝狀態(tài)紊亂是包括UC在內(nèi)的炎癥性腸病發(fā)病的重要特征之一[2]，而四神丸具有溫補脾腎之陽的功效，然其能否調(diào)控能量代謝水平達到治療UC的目的鮮見報道。本研究將通過測定大鼠結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和 Ca2+-Mg2+-ATPase活力變化，以闡述四神丸治療實驗性大鼠UC的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物及分組

健康SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供(合格證號SCXK(湘)2013-0004)。將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、四神丸高、中、低劑量組和美沙拉嗪對照組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 主要藥物和試劑

四神丸(SSP)購于北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司(生產(chǎn)批號16080053)；美沙拉嗪腸溶片購于葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制制藥有限公司(生產(chǎn)批號170438)；三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS)分子量為293.17，購于SIGMA公司(生產(chǎn)批號SLBP0899V)。

1.3 主要儀器與試劑

低溫高速離心機(德國Eppendorf)、722型分光光度計(上海儀電)；LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

參照文獻[3]和結(jié)合前期研究復(fù)制慢性復(fù)發(fā)性UC大鼠模型。第1天，動物麻醉(3%戊巴比妥0.14 ml/kg)，用0.29 mm直徑塑料軟管從肛門將0.8 ml 5%TNBS/ 50%乙醇混合溶液(3 mg/kg TNBS)注入結(jié)腸8 cm處，倒置待動物自然蘇醒。第14、28天重復(fù)上述操作，正常組注入等量生理鹽水。

2.2 給藥方法

第29天，四神丸低、中、高劑量組分別給予1.25、2.5、5 g/kg四神丸灌胃1周，美沙拉嗪對照組給予150 mg/kg美沙拉嗪灌胃1周。

2.3 標本采集及處理

第36天，動物麻醉處死，截取結(jié)腸PBS洗凈污穢物。留取部分結(jié)腸組織4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，觀察結(jié)腸病理改變；剩余組織置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活力值。

2.4 一般狀態(tài)評價

觀察動物毛發(fā)、進食、大便性狀及活動狀態(tài)。

2.5 結(jié)腸黏膜肉眼損傷評分及鏡下病理評分

觀察結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍及淋巴結(jié)等情況，測定結(jié)腸質(zhì)量和長度。參照文獻[4-5]進行結(jié)腸黏膜肉眼及鏡下結(jié)腸組織病理損傷形態(tài)學(xué)評分。

2.6 結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力值檢測

大鼠麻醉后快速脫椎處死，分離結(jié)腸組織，冰PBS溶液沖洗，制備生理鹽水組織勻漿，3500 r/min離心15 min分離上清液，并采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活力值檢測按照試劑盒說明書，采取誘導(dǎo)促酶反應(yīng)和定磷法測定其ATP酶活性，LDH、SDH活力值檢測按照試劑盒說明書規(guī)范操作，采用分光光度計法測定其活性，由南京建成生物科技有限公司完成。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般狀況變化

與正常組比較，模型組大鼠毛發(fā)暗淡不光澤、參差不齊，大便溏稀潛血、肛周污穢、少食少動、嗜睡怕冷、精神極度萎靡；各治療組與模型組比較，食量增加、活躍多動、大便成型，狀態(tài)好轉(zhuǎn)。

3.2 結(jié)腸黏膜肉眼損傷評分及鏡下病理評分結(jié)果

圖1表1顯示，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，TNBS誘導(dǎo)后大鼠結(jié)腸黏膜充血、水腫，潰瘍面形成，結(jié)腸皺襞紋理粗細雜亂；各治療組結(jié)腸黏膜充血、水腫減輕，潰瘍甚小。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組黏膜病灶可見上皮組織缺失、水腫、充血，大量炎細胞浸潤，伴見潰瘍形成；各治療組大鼠結(jié)腸基本恢復(fù)正常，伴有少量炎性細胞浸潤。與正常組比較，模型組結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸肉眼下及鏡下?lián)p傷評分均明顯升高(P<0.01)，結(jié)腸長度則明顯縮短(P<0.01)；而經(jīng)四神丸給藥治療后，與模型組比較，各給藥組結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸肉眼下及鏡下?lián)p傷評分均明顯下降(P<0.01)，結(jié)腸長度則明顯恢復(fù)(P<0.01)。上述結(jié)果表明，四神丸可有效治療慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎。

注：A.正常組；B.模型組；C.四神丸高劑量組；D. 四神丸中劑量組；E. 四神丸低劑量組；F.美沙拉嗪組圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理損傷HE染色比較 (×100)

3.3 結(jié)腸組織LDH、SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力變化

表2顯示，與正常組比較，模型組結(jié)腸黏膜組織中SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力均顯著下降 (P<0.05或0.01)，LDH活力明顯提升(P<0.05)；而各治療組均能降低LDH活力，同時顯著提升SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活力(P<0.05)。上述結(jié)果表明，四神丸可有效調(diào)控慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠能量代謝狀態(tài)和水平。

4 討論

本實驗觀察到，大鼠經(jīng)TNBS灌腸造模后，大鼠結(jié)腸黏膜損傷、炎癥細胞浸潤、潰瘍形成，肉眼及鏡下?lián)p傷評分明顯升高，與以往UC動物模型相似[6]。同時伴見Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力顯著下降，提示TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜能量代謝狀態(tài)紊亂。

表1 四神丸治療慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠的療效評價(分，

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 四神丸對慢性復(fù)發(fā)型結(jié)腸炎大鼠能量代謝相關(guān)指標影響比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

結(jié)腸上皮組織的破壞損傷是潰瘍性結(jié)腸炎的重要病理特征，而能量代謝紊亂是導(dǎo)致結(jié)腸黏膜上皮細胞通透性增加的重要原因之一[2]。ATP的耗竭可引起上皮細胞間連接骨架的萎縮、斷裂、減少，進而導(dǎo)致腸上皮細胞間隙增寬，結(jié)腸黏膜上皮間通透性增加，腸黏膜屏障破壞，致使細菌、抗原等致炎物質(zhì)穿過腸黏膜屏障，進入固有層激活炎癥反應(yīng)，最終誘導(dǎo)炎癥損傷[7]。然而能量代謝相關(guān)酶活性改變對腸上皮細胞屏障功能和能量代謝同樣具有重要意義。ATP酶(ATPase)是一種廣泛存在于哺乳動物組織細胞膜上的載體蛋白，參與細胞的物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)換過程。其中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase可利用離子梯度差通過與各離子親和力的改變，將細胞內(nèi)外的電離子、營養(yǎng)物和代謝物等逆電化學(xué)梯度從低濃度側(cè)向高濃度側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運，這種耗能的主動運輸方式對細胞滲透壓的平衡和細胞體積的恒定有重要意義，也為細胞生長發(fā)育提供了能量及物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性腸炎動物模型的腸絨毛細胞存在Na+-K+-ATPase活性下降，究其原因與細胞連接骨架錨定蛋白的表達能力退化有關(guān)[9]。進一步提示，能量的缺乏是鈉鉀泵和鈣鎂泵功能異常的重要原因之一。LDH是葡萄糖無氧酵解的關(guān)鍵酶，當結(jié)腸組織受到損害時，可導(dǎo)致局部組織缺氧，代謝物大量堆積，自由基增多，進而引起細胞膜破損。而細胞可通過啟動保護性代償機制，增加LDH的分泌，催化乳酸氧化，故LDH可作為腸上皮細胞的損傷監(jiān)測指標[10]。SDH為有氧代謝(三羧酸循環(huán))的限速酶和線粒體的標志酶，通過其活性的改變可直接反映有氧反應(yīng)的強弱和間接反映線粒體功能的好壞，可作為腸上皮細胞能量供給的參考[11]。在本實驗中，TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸黏膜時，使局部組織缺氧，能量代謝紊亂，骨架蛋白支撐乏力，ATP酶活力下降，正常電解質(zhì)轉(zhuǎn)運破壞，細胞受損，腸黏膜屏障功能受損，進而導(dǎo)致致病因素入侵，炎性損傷產(chǎn)生，潰瘍形成，提示能量代謝狀態(tài)紊亂是結(jié)腸炎的重要特征之一。經(jīng)四神丸治療后，結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸質(zhì)量、長度和病理損傷評分得到改善的同時，結(jié)腸組織LDH活力隨之降低，SDH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力則相應(yīng)提升。這與之前發(fā)現(xiàn)補骨脂連用肉豆蔻可改善大鼠肝組織能量代謝的結(jié)果相符[12]。進一步揭示了四神丸有效治療慢性復(fù)發(fā)性UC的機制可能是通過干預(yù)腸上皮細胞的能量代謝，增加其能量供給，保證鈉鉀泵和鈣鎂泵的正常運行，以平衡細胞的滲透壓，恒定細胞體積，保持腸上皮細胞屏障的完整性，進而減少致炎物質(zhì)的侵入，緩解腸道炎癥。但四神丸如何產(chǎn)生能量，與哪些基因或信號有關(guān)，是否存在免疫細胞活化都有待于進一步的深入研究。