祝海棟， 李瑞琳， 何小雨， 趙 丹， 韓鑫胤， 牛北方

(中國(guó)科學(xué)院 計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)信息中心，北京 100190)

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 計(jì)算機(jī)與控制學(xué)院，北京 100190)

小麥生產(chǎn)對(duì)保證糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，促進(jìn)小麥的增產(chǎn)和品質(zhì)改良成為當(dāng)前小麥育種研究的前沿?zé)狳c(diǎn). 為了培育具有優(yōu)良性狀的新品種，首先要定位控制目標(biāo)性狀的基因，因此建立一套完整準(zhǔn)確的大尺度基因組注釋流程成為培育新品種過(guò)程中的難點(diǎn)之一. 基因組注釋主要包括基因識(shí)別和基因功能標(biāo)注兩個(gè)方面[1]，本文的主要研究方向是基因識(shí)別，主要目標(biāo)是準(zhǔn)確定位基因位置及發(fā)現(xiàn)物種特異性基因.

近些年，基因組測(cè)序技術(shù)突飛猛進(jìn)，其發(fā)展過(guò)程包含三個(gè)階段：1975年由桑格和考爾森開(kāi)創(chuàng)的鏈終止法標(biāo)志著第一代DNA測(cè)序技術(shù)的誕生，但測(cè)序成本高、通量低等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了其大規(guī)模的應(yīng)用; 第二代測(cè)序建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，主要特點(diǎn)是為邊合成邊測(cè)序，測(cè)序結(jié)果讀長(zhǎng)短、測(cè)序速度快、吞吐量大[2]; 第三代測(cè)序技術(shù)的核心是以單分子為目標(biāo)，旨在解決第二代測(cè)序在準(zhǔn)確性和組裝困難方面的問(wèn)題.測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，大大滿足了測(cè)序深度、重測(cè)序等大規(guī)?；蚪M的研究需求，改變了生命科學(xué)諸多領(lǐng)域的研究面貌，也給小麥等大尺度基因組的注釋研究奠定了重要基礎(chǔ).

1 小麥基因組注釋流程研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)的基因注釋方法主要為數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，通過(guò)把基因組片段與已有的親緣物種基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到目標(biāo)基因. 這種方法較為簡(jiǎn)便，但具有三個(gè)明顯的缺點(diǎn)：一是對(duì)比速度慢，原因是該方法中需要與較多的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，因此耗時(shí)長(zhǎng)，尤其是用于小麥等較大基因組時(shí)該缺點(diǎn)更為明顯; 二是難以發(fā)現(xiàn)新的基因，由于依賴數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到的基因都是目前相近物種中廣泛存在的基因，物種特有的基因不會(huì)被識(shí)別，造成注釋的不完整. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以全面快速的獲取物種在某一時(shí)期和特定組織中所有表達(dá)的基因序列，常被用于研究物種基因結(jié)構(gòu)和基因功能[3]. 但是轉(zhuǎn)錄組分析軟件繁多，缺乏統(tǒng)一的選擇標(biāo)準(zhǔn)，且分析過(guò)程中涉及多個(gè)軟件配合完成，分析流程中不可避免地會(huì)存在軟件間銜接困難、格式轉(zhuǎn)換和大量數(shù)據(jù)重復(fù)讀寫(xiě)等問(wèn)題. 另外，由于各種軟件在內(nèi)存、CPU等資源利用方面存在較大差異，且多數(shù)情況下生物信息學(xué)中的分析過(guò)程依賴于腳本生成的流程，沒(méi)有并行優(yōu)化，因此資源利用率和分析效率較低. 針對(duì)上述問(wèn)題，本文提出了整合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因注釋的分析流程，以提高注釋的完整性和準(zhǔn)確性.

2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與測(cè)試環(huán)境

本次研究中使用的測(cè)試數(shù)據(jù)包括：科農(nóng)9204小麥基因組組裝數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)大小14.24 GB; 二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本77個(gè)，單樣本大小約為17 GB; 三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本2個(gè)，單樣本大小約為40 GB. 測(cè)試環(huán)境為超級(jí)計(jì)算系統(tǒng)“元”. 其包含270臺(tái)計(jì)算節(jié)點(diǎn)，每節(jié)點(diǎn)采用2個(gè)Intel Xeon E5-2680V3處理器(2.5 GHz、12核)，單節(jié)點(diǎn)CPU計(jì)算能力 0.96Tflops，配備256 GB內(nèi)存.操作系統(tǒng)為L(zhǎng)inux version 2.6.32-358.el6.x86_64，CentOS release 6.4 (Final). 系統(tǒng)中配置Python、Perl、C++等基本編譯和運(yùn)行環(huán)境.

3 基因組注釋分析軟件流程

本節(jié)分為3個(gè)部分，建立小麥基因組注釋分析流程，并對(duì)部分環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化.

3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋

數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋是最傳統(tǒng)和最常用的注釋方式.其主要方法是把待注釋的基因組逐一與各個(gè)近親物種已有基因比對(duì)，獲取注釋結(jié)果. TriAnnot[4]是為解讀小麥基因組而開(kāi)發(fā)的一個(gè)流程，集合了Blast、Repeat Masker等開(kāi)源軟件，比對(duì)了NCBI[5]、TAIR10[6]等開(kāi)放數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)轉(zhuǎn)座子、編碼基因、非編碼序列、分子標(biāo)記進(jìn)行了多步的處理分析，可以得到比較完整的注釋結(jié)果. 因此，本文對(duì)TriAnnot注釋軟件進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)科農(nóng)9204小麥基因組進(jìn)行初步注釋.

3.1.1 優(yōu)化方法

為了提高注釋效率，本研究的主要貢獻(xiàn)是實(shí)現(xiàn)TriAnnot注釋軟件的優(yōu)化，重點(diǎn)分為3個(gè)方面：?jiǎn)稳蝿?wù)多實(shí)例并行優(yōu)化、多核計(jì)算并行優(yōu)化，多數(shù)據(jù)庫(kù)查找并行優(yōu)化，下面給出具體的方法與實(shí)現(xiàn).

首先，對(duì)TriAnnot注釋軟件的單任務(wù)多實(shí)例并行優(yōu)化. 六倍體小麥基因組較大，每條染色體的平均長(zhǎng)度接近700 MB，給序列比對(duì)帶來(lái)許多困難. 為了便于比對(duì)分析，在注釋過(guò)程中，必須把染色體切分成小的片段，本研究中選擇的切分大小為1 MB，切分時(shí)的保留的重復(fù)長(zhǎng)度為50 KB. 切分后的每個(gè)片段即為每個(gè)實(shí)例，實(shí)例之間相對(duì)獨(dú)立. 為了提高注釋速度，本研究采用了多實(shí)例并行，即在每個(gè)時(shí)刻都有多個(gè)實(shí)例同時(shí)執(zhí)行. 因?yàn)槊總€(gè)步驟的CPU和內(nèi)存使用率各不相同，該優(yōu)化策略可以實(shí)現(xiàn)資源的充分利用.

其次，實(shí)現(xiàn)TriAnnot注釋軟件的單任務(wù)多實(shí)例并行優(yōu)化. 在實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)每個(gè)軟件的特點(diǎn)，本研究采用相應(yīng)的調(diào)度方式優(yōu)化. RepeatMasker通過(guò)相似性比對(duì)來(lái)識(shí)別重復(fù)序列，可以屏蔽序列中轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列和低復(fù)雜度序列[7]. 本研究在流程中加入了RepeatMasker的多核心并行，可以根據(jù)機(jī)器硬件情況指定4至24核心實(shí)現(xiàn)并行運(yùn)行，并且可以通過(guò)使用-qq指令加快比對(duì)效率.

最后，實(shí)現(xiàn)對(duì)TriAnnot注釋軟件的多數(shù)據(jù)庫(kù)查找并行優(yōu)化. SIMSearch軟件通過(guò)使用多個(gè)同源數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)找到親緣關(guān)系較近的基因序列. 為了加快同源基因的查找速度，研究采用了多數(shù)據(jù)庫(kù)并行的方案，把多個(gè)同源數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)讀取到內(nèi)存中，將每個(gè)基因片段在多個(gè)核心上與不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比.

3.1.2 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

TriAnnot依賴的軟件及其下載地址如表1所示，數(shù)據(jù)庫(kù)及其下載地址如表2所示.

表1 TriAnnot主要依賴軟件

表2 TriAnnot主要數(shù)據(jù)庫(kù)

3.1.3 分析流程

該步驟的輸入為基因組裝得到的KN9204小麥基因序列文件. 六倍體小麥有21條染色體，此外還有少量未有效定位到染色體上的基因片段，在其中加入100個(gè)未知堿基標(biāo)識(shí)“N”，構(gòu)成未分組染色體，共22條fasta序列，每條序列單獨(dú)輸入.

TriAnnot軟件運(yùn)行前需要下載完整的基因數(shù)據(jù)庫(kù).主要參數(shù)包括：-W指定工作目錄，-s指定輸入的fasta文件，-t指定注釋流程xml文件，--type設(shè)置輸入為核酸，--maxlength設(shè)置最大序列長(zhǎng)度，--splitseq設(shè)置超過(guò)最大長(zhǎng)度的序列自動(dòng)切分，--overlap設(shè)置切分時(shí)冗余長(zhǎng)度.

軟件的輸出為gff文件，包含了詳細(xì)的內(nèi)含子、外顯子、編碼區(qū)、轉(zhuǎn)座子等注釋.

3.2 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序

為了準(zhǔn)確注釋物種特異性基因，本研究結(jié)合了轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，選取了苗期、孕穗期、7天、14天等不同時(shí)期的根、葉、穗等不同組織的樣本，測(cè)序深度約為30 X. 常用的轉(zhuǎn)錄組分析工具有HISAT、SATR、StringTie、Cufflinks等. 使用不同的分析工具和方法對(duì)分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和耗時(shí)影響較大，需要根據(jù)特定的數(shù)據(jù)集及特定的研究目標(biāo)選擇合適的分析工具和方法. HISAT解決了轉(zhuǎn)錄組中僅有不連續(xù)的外顯子難以比對(duì)的問(wèn)題，對(duì)比上代主流轉(zhuǎn)錄組比對(duì)工具Tophat效率高50倍，且內(nèi)存需求更少[8]. StringTie繼承于Cufflinks，在準(zhǔn)確性方面有了較大提升，且可以通過(guò)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋結(jié)果提高在已知基因區(qū)域的準(zhǔn)確性，在組裝的過(guò)程中會(huì)計(jì)算每個(gè)基因及可變剪切的表達(dá)水平. 綜合以上優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于復(fù)雜的小麥基因組，本文使用HISAT[9]和StringTie[10]工具進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝.主要分為以下四個(gè)步驟

(1) 建立HISAT2基因組索引. 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析過(guò)程遇到的第一個(gè)問(wèn)題就是，小麥上億條reads如何在保證錯(cuò)誤率在可接受的范圍內(nèi)，高效率地比對(duì)到基因組上. 針對(duì)上述問(wèn)題，需要根據(jù)基因組序列使用hisat2-build命令建立索引.

(2) 將所有二代測(cè)序reads比對(duì)到基因組. 使用HISAT2利用基因組索引將高通量測(cè)序reads比對(duì)到基因組上. 參數(shù)-p指定并行核心數(shù)，-x指定索引位置，--dta為組裝提供錨點(diǎn). 使用samtools將比對(duì)結(jié)果按染色體和起始位點(diǎn)排序.

(3) 使用StringTie對(duì)排序完成的reads進(jìn)行組裝.不同組織中表達(dá)數(shù)據(jù)差異相對(duì)較大，比對(duì)到基因組的reads也各有不同，這些因素都會(huì)影響組裝的效率.

(4) 將所有轉(zhuǎn)錄本的組裝結(jié)果使用StringTie的merge模塊合并. 由于不同組織和不同時(shí)期表達(dá)的基因各不相同，為了獲取更加完整的注釋，需要對(duì)多個(gè)測(cè)序樣本合并. merge步驟可以跨多個(gè)測(cè)序樣本生成統(tǒng)一的轉(zhuǎn)錄本. 首先要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)文本文件，該文件包含所有轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果路徑，文本的每行是單個(gè)樣本組裝結(jié)果文件路徑. 參數(shù)設(shè)置為：--merge指定使用合并模塊，-p指定并行核心數(shù)，輸入上述文本文件，即可得到最終的二代轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果.

3.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組單分子測(cè)序數(shù)據(jù)處理

二代測(cè)序可以準(zhǔn)確地進(jìn)行基因定量分析研究，但是受讀長(zhǎng)限制，不能得到全轉(zhuǎn)錄本的信息. 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建啞鈴型文庫(kù)，以環(huán)形方式循環(huán)測(cè)序[11]. 因此，通過(guò)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組單分子測(cè)序可以不經(jīng)過(guò)組裝，準(zhǔn)確、直接地獲取整個(gè)轉(zhuǎn)錄本. 三代測(cè)序存在單堿基錯(cuò)誤率較高的問(wèn)題[12]，本研究使用PacBio公司發(fā)布的SMRTLINK Pipeline[13]，對(duì)三代測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾與質(zhì)量控制. 由于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成本相對(duì)較高，本次研究采取了常用的組織混合測(cè)序方式. 選取了葉、穗、幼葉、幼根四種組織混合，設(shè)置兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共得到兩組測(cè)序數(shù)據(jù). 數(shù)據(jù)處理過(guò)程主要分為以下3個(gè)步驟：

(1) 使用SMRTLINK進(jìn)行三代測(cè)序數(shù)據(jù)的清洗.主要分為三個(gè)步驟，首先召回環(huán)形一致性序列，包括單堿基糾錯(cuò)和序列過(guò)濾; 然后對(duì)序列分類，包括去除接頭、polyA尾部和串聯(lián)子; 最后進(jìn)行迭代的聚類糾錯(cuò)，主要是合并相似的序列，形成全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本. 該軟件提供了用戶可視化接口，安裝后使用瀏覽器訪問(wèn)服務(wù)器地址的對(duì)應(yīng)端口即可進(jìn)入管理界面. 在管理界面中，使用“數(shù)據(jù)管理”選項(xiàng)導(dǎo)入原始測(cè)序結(jié)果文件，然后使用“SMRT分析”選項(xiàng)，選擇分析流程為“Iso-Seq”，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，選取對(duì)應(yīng)的樣本即可開(kāi)始全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的糾錯(cuò).在本次研究中，我們?cè)O(shè)置的參數(shù)主要有以下幾個(gè)：By Strand CCS：OFF; Maximum Dropped Fraction：0.8;Maximum Subread Length：15000; Minimum Predicted Accuracy：0.75; Minimum SNR：3.75; Polish CCS：ON;

其余參數(shù)均為默認(rèn)值.

(2) 使用GMAP[14]比對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本到基因組.GMAP具有一次對(duì)多條reads同時(shí)進(jìn)行比對(duì)的優(yōu)點(diǎn)，比對(duì)結(jié)果較為可靠，因此，本文采用GMAP將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到基因組上. 為了提高運(yùn)算速度，GMAP比對(duì)階段對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分割，將分割后的多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行并行處理. 首先使用gmap-build建立索引，由于小麥基因組較大，會(huì)自動(dòng)使用長(zhǎng)索引. 使用-D參數(shù)指定索引存儲(chǔ)位置，-d參數(shù)指定索引前綴，輸入基因組fasta文件即可開(kāi)始建立索引，然后使用gmapl命令開(kāi)始比對(duì). 指定的索引存儲(chǔ)位置和前綴需與上述過(guò)程中對(duì)應(yīng)參數(shù)相同，-B指定批處理個(gè)數(shù)，-t指定并行核心數(shù)，-f指定輸出格式，-O指定順序輸出. 使用samtools將bam文件按染色體和起始位點(diǎn)排序.

(3) 合并多個(gè)樣本的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果. 合并時(shí)使用TAMA軟件，共分為兩個(gè)步驟. 首先根據(jù)比對(duì)到基因組上的位置情況合并可變剪切，然后合并多個(gè)測(cè)序樣本的轉(zhuǎn)錄本.

3.4 合并注釋結(jié)果

為了得到高質(zhì)量的注釋結(jié)果，需對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行合并和過(guò)濾，在本次研究中我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)自動(dòng)化合并注釋的軟件Annotator，該軟件包含的功能模塊有格式轉(zhuǎn)換，結(jié)果合并，去除重復(fù)序列，過(guò)濾可變剪切，根據(jù)證據(jù)支持評(píng)價(jià)可信度，編碼區(qū)預(yù)測(cè)，蛋白翻譯等多個(gè)步驟，最終生成gff注釋文件和轉(zhuǎn)錄本序列、編碼區(qū)序列、編碼蛋白序列. Annotator詳細(xì)流程如圖1所示. 合并過(guò)程分為以下5個(gè)步驟：

(1) 轉(zhuǎn)換結(jié)果文件為bed12格式. 本步驟調(diào)用了cufflinks[15]軟件的gffread模塊和bedops[16]軟件，將數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋得到gff文件和二代轉(zhuǎn)錄組組裝得到的gtf文件轉(zhuǎn)換為bed文件. bed格式使用單行定義單個(gè)基因，具有簡(jiǎn)單易讀的特點(diǎn).

圖1 注釋合并流程

(2) 合并數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋、二代轉(zhuǎn)錄組組裝、三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果. 本步驟使用了TAMA的merge模塊，生成含有全部基因的bed文件. 根據(jù)每個(gè)基因的支持證據(jù)的不同，分為高可信度基因和低可信度基因.

(3) 過(guò)濾重復(fù)的可變剪切. 由于測(cè)序誤差或reads組裝錯(cuò)誤的不可避免，測(cè)序結(jié)果中可變剪切會(huì)出現(xiàn)許多冗余，因此需要對(duì)重復(fù)的可變剪切進(jìn)行過(guò)濾. 過(guò)濾過(guò)程中，保留的優(yōu)先級(jí)依次為全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組得到的可變剪切結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋結(jié)果中的可變剪切，由于二代轉(zhuǎn)錄組組裝有更多的錯(cuò)誤可能，其優(yōu)先級(jí)最低.

(4) 預(yù)測(cè)所有基因的編碼區(qū). 該步驟使用三種可能的翻譯方式分別將基因翻譯為氨基酸序列，取最長(zhǎng)的序列，得到基因的編碼區(qū).

(5) 翻譯編碼區(qū)序列. 根據(jù)注釋結(jié)果中的編碼區(qū)位置，將核酸序列翻譯為氨基酸序列，生成序列文件.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，使用TriAnnot注釋科農(nóng)9204基因組的重復(fù)序列時(shí)，速度提升達(dá)到60%，在1號(hào)染色體上的測(cè)試結(jié)果如圖2所示.

在轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序過(guò)程中，建立索引過(guò)程輸入全基因組大小約為14 GB，耗時(shí)為8122秒，最大內(nèi)存使用約為144 GB. 序列比對(duì)時(shí)，輸入共77個(gè)樣本，雙端測(cè)序的單個(gè)fastaq文件大小約17 GB，比對(duì)耗時(shí)約640秒. StringTie組裝輸入bam文件大小約為7 GB，耗時(shí)在10小時(shí)至24小時(shí)不等.三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中單樣本bam文件為38 GB，運(yùn)行時(shí)間約為149小時(shí). 最終分別輸出高質(zhì)量和低質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組fasta序列. 最終得到的環(huán)形一致性序列質(zhì)量分布如圖3所示，超過(guò)50%的序列質(zhì)量均在0.99以上，可信度較高.

圖2 注釋耗時(shí)變化

圖3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量分布

本流程在六倍體小麥科農(nóng)9204基因組上完成測(cè)試，共注釋出110 326個(gè)高可信度基因. 對(duì)比同源的中國(guó)春小麥基因組，其注釋包含107 891個(gè)高可信度基因[17]，其中有102 413個(gè)基因匹配，占中國(guó)春基因總數(shù)的94.9%，占科農(nóng)9204基因總數(shù)的92.8%，具有高度一致性，這說(shuō)明了本流程注釋結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性.

5 結(jié)論與展望

本文提出了一種綜合運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、二代轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序、三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得準(zhǔn)確注釋的分析流程，并獨(dú)立研發(fā)了注釋軟件Annotator. 隨后對(duì)流程中用到的部分軟件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了注釋效率，為大尺度多倍體基因組提供了一個(gè)較為成熟的注釋軟件流程.

當(dāng)前流程也存在一些問(wèn)題：(1) 注釋速度仍然較慢.數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋過(guò)程是性能提升的主要瓶頸，仍需優(yōu)化. (2) 成本較高. 注釋的準(zhǔn)確性依賴于較高的測(cè)序深度，這會(huì)帶來(lái)成本的大幅提高，尤其是三代測(cè)序更為如此，這大大限制了該流程的廣泛應(yīng)用.

因此，在未來(lái)的工作中將嘗試解決上述問(wèn)題，以進(jìn)一步優(yōu)化整個(gè)流程. 針對(duì)注釋速度問(wèn)題，可以對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行更細(xì)粒度的并行處理，提升比對(duì)過(guò)程中的并行效率; 此外可以使整個(gè)比對(duì)過(guò)程均在內(nèi)存中進(jìn)行，避免中間結(jié)果寫(xiě)入硬盤(pán)，減少不必要的時(shí)間開(kāi)銷. 針對(duì)注釋中測(cè)序成本問(wèn)題，可以在成本較高的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中采取多組織混樣測(cè)序的方案，選取最關(guān)注的組織和時(shí)期的樣本混合，通過(guò)單次測(cè)序降低成本.