楊雨佳 羅赤苗 陳嘉勤 彭琦

【摘要】探討水飛薊賓通過iNOS/NF-KB信號通路對梗阻性黃疸小鼠肝細(xì)胞修復(fù)與再生的作用機(jī)制。構(gòu)建小鼠梗阻性黃疸模型20只，隨機(jī)分成模型組（M）、藥物組（S）、空白組（S0）。發(fā)現(xiàn)構(gòu)模小鼠皮膚黃染嚴(yán)重，肝索紊亂，血液中總TBIL及AST超標(biāo)，出現(xiàn)空泡及核裂變，iNOS、NF-KB、TNF-a、Par-4mRNA表達(dá)上升。S組有較明顯改善。提示水飛薊賓能增強(qiáng)梗阻性黃疸致肝損傷后小鼠的免疫功能及肝細(xì)胞的修復(fù)能力，其機(jī)制可能是通過調(diào)控iNOS/NF-KB通路相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)和保持肝細(xì)胞的完整性。

【關(guān)鍵詞】水飛薊賓;阻塞性黃疸致肝損傷;iNOS/NF-KB;TNF-α;小鼠

1前言

由于各種因素導(dǎo)致肝內(nèi)外膽管阻塞引起膽汁流通障礙是梗阻性黃疸發(fā)生的主要原因。水飛薊賓是從罕見的菊利植物水飛薊果實(shí)中提取分離的黃酮類化合物，能保證肝細(xì)胞膜的完整性和修復(fù)性。在病理情況下iNOS表達(dá)顯著升高產(chǎn)生NO，造成細(xì)胞代謝障礙及增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。聯(lián)合NF-KB能調(diào)控組織損傷中多種炎癥介質(zhì)的編碼基因。本研究以阻塞性黃疸構(gòu)建小鼠肝損傷模型，通過水飛薊賓干預(yù)，觀察肝組織iNOS、NF-KB、TSF-α、Par-4的表達(dá)，探討其在阻塞性黃疸致肝損傷、修復(fù)相關(guān)機(jī)制，為相關(guān)疾病研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)對象及模型構(gòu)建

健康昆明種雄性小鼠30只，構(gòu)建小鼠梗阻性黃疸模型20只，隨機(jī)分成模型組（M）、藥物組（S），設(shè)空白組（SO）10例。水飛薊賓灌胃：按人與小鼠體表面積折算等效劑量經(jīng)口灌胃，每天（下午4時(shí)）灌胃一次，劑量0.4mL/次（濃度為30mg/kg），7d/w，共7周。構(gòu)模：腹腔注射異戊巴比妥（500mg/kg）進(jìn)行麻醉。腹部劍突下1cm進(jìn)行局部消毒，并剪去毛發(fā)。眼科剪縱向開l.2cm手術(shù)切口，暴露肝臟，棉絮棒輕微撥開肝葉，暴露膽總管，玻璃分針進(jìn)行分離，4-0不可吸收手術(shù)線將其成90。彎曲懸掛于腹壁，縫合切口。

2.2一般情況及血生化觀察

對所有小鼠肝臟形態(tài)、排泄物、活動(dòng)狀態(tài)等進(jìn)行綜合性評價(jià)。血清中總膽紅素（TBIL）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量檢測按照說明書操作步驟在半自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行。

2.3病理學(xué)切片

取厚3.0mm石蠟切片，脫蠟、脫水，HE染色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡（X²00）下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)。

2.4肝組織iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA檢測

總mRNA提取采用動(dòng)物組織RNAprepPure Tissue Kit試劑盒;并按說明書進(jìn)行操作。儀器：ABI 7900HT，試劑：SYBRPremix Ex Taq^TM（Takara）試劑盒。按說明書進(jìn)行操作，引物合成設(shè)計(jì)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用中文SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用SigmaPlotl0.0軟件作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，組間對比分析采用單因素方差分析方法，若P<0.05表示為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若P<0.01表示為具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果與分析

3.1一般行為學(xué)及生化檢測

SO組小鼠肝臟顏色紅潤，質(zhì)地柔軟。M組呈暗褐色，顯現(xiàn)顆粒狀突起且興奮性降低，糞便呈現(xiàn)蒼白色。S組癥狀有明顯好轉(zhuǎn)。血生化結(jié)果表明，與M（84.34±9.07）相比，S組的血清ALT（50.18±7.61）含量顯著下降（P<0.01）。TBIL含量M組（27.25±4.92）明顯高于s組（7.64±4.18），具有非常顯著性差異（P<0.01）。

3.2HE染色

肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)：M組肝索結(jié)構(gòu)紊亂，存在大量核固縮、空泡，甚至消失。肝小葉破壞顯著，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)斑狀聚集。相比M組，S組肝小葉損傷緩解，有少量空泡，肝索結(jié)構(gòu)清晰可見。SO組無明顯病變癥狀。

3.3qRT-PCR結(jié)果

qRT-PCR檢測結(jié)果，肝組織中iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表達(dá)在M組中表達(dá)最高，S組相對降低（P<0.01）;相比S組，SO組各因子mRNA表達(dá)明顯下降（P<0.01）。

4討論

梗阻性黃疸疾病的主要原因是肝內(nèi)外膽管完全或不完全阻塞，導(dǎo)致膽汁淤積所致。其表現(xiàn)為膚色、鞏膜出現(xiàn)黃染，血清總膽紅素明顯增加。抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，降低炎性因子的釋放，促進(jìn)機(jī)體免疫功能的恢復(fù)，防止誘發(fā)其它并發(fā)癥是治療梗阻性黃疸病致肝損傷的首要目標(biāo)，在科研實(shí)驗(yàn)中能較好模擬人類梗阻性黃疸發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型成為研究的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠作為研究對象，懸掛膽總管造成膽管阻塞構(gòu)建梗阻性黃疸模型，構(gòu)模后小鼠腹部等多處出現(xiàn)黃染，血清總膽紅素等多項(xiàng)生化指標(biāo)超標(biāo)。故判斷模型構(gòu)建成功，并應(yīng)用于本研究。

目前，調(diào)控細(xì)胞因子與免疫系統(tǒng)的關(guān)系受到研究者們的關(guān)注。梗黃的發(fā)生可促進(jìn)相關(guān)炎性細(xì)胞因子的超負(fù)荷釋放，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，調(diào)控或抑制單一炎癥介質(zhì)無法有效影響整個(gè)免疫介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。故尋找炎癥反應(yīng)上游重要調(diào)控因子，并清楚各因子間的作用機(jī)制，才能得到有效的干預(yù)效果。梗黃致肝損傷后促使活化的白細(xì)胞聚集于肝組織微血管，激活大量炎性介質(zhì)，同時(shí)中性粒細(xì)胞募集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生NF-KB能調(diào)控組織損傷中多種炎癥介質(zhì)的編碼基因，加重炎癥反應(yīng)。聯(lián)合iNOS可產(chǎn)生劇烈細(xì)胞毒性效果，本實(shí)驗(yàn)中，肝組織iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4mRNA表達(dá)顯著增多，提示小鼠肝組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，S組iNOS、NF-KB、TNF-α、Par-4蛋白及mRNA相比M組降低顯著，提示7周水飛薊賓灌胃可減輕或緩解肝損傷。

5結(jié)論

水飛薊賓能緩解或減輕梗阻性黃疸小鼠肝損傷的進(jìn)一步擴(kuò)張，其機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)iNOS/NF-KB信號通路，加強(qiáng)梗黃小鼠免疫及抗炎能力，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)與再生。