劉永濤，韓 剛，宋金龍，董 靖，胥 寧，楊移斌，楊秋紅，艾曉輝*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100141;3.湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜帶紫外檢測器(TUV,美國Waters公司)；Mettler-Toledo AE-240電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Hitachi 20PR-520型自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；FS-1高速勻漿機(jī)(華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)；調(diào)速混勻器(上?？等A生化儀器制造廠)；HGC-12氮吹儀(Hengao T&D公司)。

50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)：稱取磷酸二氫鈉3.12 g溶于蒸餾水，定容至100 mL(A液)；稱取磷酸氫二鈉7.17 g溶于蒸餾水，定容至100 mL(B液)。量取39 mL A液和61 mL B液混合，定容至400 mL，即得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚組織的預(yù)處理魚取血后，有磷魚去除鱗片，取自然比例的帶皮肌肉、肝臟、腎臟和鰓等組織，無鱗魚直接取自然比例的帶皮肌肉、肝臟、腎臟和鰓等組織。血液樣品以3 500 r/min離心5 min后，取血漿置于離心管中，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫黄渌鼧悠肪|(zhì)后，于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 魚血漿樣品的處理采用液-液萃取法進(jìn)行血漿樣品的前處理：取血漿樣品在室溫下自然解凍，準(zhǔn)確量取1 mL血漿置于10 mL離心管中。加入1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)，渦旋振蕩30 s，再加入5 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min，取上層乙酸乙酯層置于另一10 mL離心管中。向殘?jiān)屑尤? mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并提取液于另一10 mL離心管中，置45 ℃氮吹儀上氮吹至干，加入1 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，渦旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min，液體過0.22 μm針式尼龍濾頭后，進(jìn)行UPLC測定。

1.2.3 自然比例帶皮肌肉、肝臟、腎臟和腮組織樣品的處理采用改良的QuEChERS方法進(jìn)行樣品前處理：將自然比例帶皮肌肉、肝臟、腎臟和腮組織樣品在室溫下自然解凍，分別稱取上述樣品2.0 g置于15 mL離心管中，加入6 mL乙腈，渦旋振蕩混勻30 s，超聲提取1 min，再加入2 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩30 s，8 000 r/min離心5 min，取上清液置于另一15 mL離心管中。向殘?jiān)屑尤? mL乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液于15 mL離心管中，在該離心管中加入500 mg無水硫酸鎂和100 mg C18粉渦旋振蕩30 s，5 000 r/min離心5 min，將乙腈層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，置50 ℃氮吹儀上氮吹至干，加入2 mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)瑴u旋振蕩30 s，10 000 r/min離心5 min，下層液體過0.22 μm針式尼龍濾頭后，進(jìn)行UPLC測定。

1.2.5 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；紫外檢測波長：270 nm，數(shù)據(jù)模式：吸光度-基線中值濾波(MBF)模式；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，15%A；1.0～2.0 min，15%～25%A；2.0～3.0 min，25%～35%A；3.0～7.0 min，35%A；7.0～8.0 min，35%～15%A；8.0～9.0 min，15%A。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

圖1 0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)與50 μg/kg斑點(diǎn)叉尾鮰自然比例帶皮肌肉空白加標(biāo)(B)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 0.1 mg/L standard solution(A) and 50 μg/kg spiked channel catfish muscle and skin in natural proportions(B)

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.2 帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化對于魚的帶皮肌肉、肝臟、腎臟等樣品，干擾測定的主要成分為脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)。分別考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取劑的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取劑時(shí)提取液很難揮干。乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，提取液中脂肪濃度高，增加了凈化難度。而乙腈因?qū)χ镜奶崛÷实停铱梢猿恋淼鞍妆煌扑]作為提取劑[19]。本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品的提取劑。

圖2 組合凈化劑的用量對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of combined clean-up reagent amount on the recoveries of target compounds

QuEChERS方法的常用凈化劑有無水硫酸鎂、C18粉和N-丙基乙二胺(PSA)。其中，無水硫酸鎂可除去樣品中的水分和沉淀部分蛋白；C18粉可吸附溶液中弱極性的脂肪、多環(huán)芳烴等干擾物；PSA主要用于去除糖類、脂肪酸等極性干擾物，但其對磺胺類藥物有明顯吸附[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇無水硫酸鎂作為除水和蛋白沉淀劑，無水硫酸鎂+C18粉作為凈化劑，除去提取液中的水分和脂肪。以自然比例帶皮肌肉組織中加標(biāo)0.5 mg/kg的回收率作為指標(biāo)，對無水硫酸鎂(200、500、900 mg)和C18粉用量(50、100、150 mg)進(jìn)行了優(yōu)化。由圖2可知，以500 mg無水硫酸鎂+100 mg C18粉為凈化劑時(shí)的效果最佳，因此選其作為帶皮肌肉、肝臟、腎臟、鰓樣品的凈化劑。

2.2.3 定容溶液的選擇分別采用乙腈-甲醇-2%乙酸水溶液(5∶10∶85，體積比)[21-22]和初始流動(dòng)相甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85,體積比)作為樣品殘?jiān)亩ㄈ萑芤?，樣品定容后過0.22 μm針式尼頭濾頭進(jìn)行UPLC分析。結(jié)果表明，以前者為定容溶液時(shí)，定容液中的雜質(zhì)對TMP的定量造成干擾。而以甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)為定容溶液時(shí)，3種分析物的峰形對稱且無干擾峰(見圖1B)。因此，最終選擇甲醇-0.1%乙酸水溶液(15∶85)為定容溶液。

2.3 方法的線性關(guān)系

2.4 回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限與定量下限

分別在5種魚組織空白樣品中添加5個(gè)濃度水平的3種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度做6個(gè)平行，結(jié)果見表1。由表1可知，3種目標(biāo)物的平均回收率為68.2%～97.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～13%。采用本方法測定加標(biāo)樣品，分別以大于3倍和10倍信噪比計(jì)算方法檢出限和定量下限，結(jié)果顯示，3種目標(biāo)物在5種魚組織中的檢出限均為25 μg/kg，定量下限均為50 μg/kg。參照歐盟對磺胺類藥物和甲氧芐啶在自然比例的帶皮魚肌肉中的最高殘留限量100 μg/kg和50 μg/kg[12]，本方法的檢出限和定量下限均滿足檢測要求。

表1 魚組織中磺胺甲唑、乙酰磺胺甲唑和甲氧芐啶的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of SMZ,N-ac-SMZ and TMP in fortified fish tissue samples(n=6)

*standard deviation

2.5 方法應(yīng)用

3 結(jié) 論