魯海珍，尹英愛，呂寧

100021 北京，國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院 病理科(魯海珍、呂寧)；102401 北京，首都醫(yī)科大學(xué)良鄉(xiāng)教學(xué)醫(yī)院 病理科(尹英愛)

喉癌的主要治療方法是手術(shù)和放療，初治后復(fù)發(fā)并不少見，給患者帶來后續(xù)治療的痛苦，影響患者的生存質(zhì)量和生存期，也給臨床治療帶來挑戰(zhàn)。如何篩選與復(fù)發(fā)相關(guān)的危險(xiǎn)因素，是頭頸領(lǐng)域研究者奮斗的方向之一[1]。喉癌的組織學(xué)類型絕大部分是鱗狀細(xì)胞癌(文中簡稱喉癌)，癌前病變?yōu)轺[狀上皮中-重度不典型增生、原位癌。影響喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)的因素復(fù)雜多樣[2]。為探討喉癌復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，我們回顧性分析95例喉癌及癌前病變患者的病例資料，分析腫瘤分子標(biāo)志物(包括p53、c-Myc、PTEN、survivin、p21和p27)表達(dá)情況及臨床病理因素與喉癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病案室編目組、病理科數(shù)字檔案管理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，自1999年1月至2015年12月喉癌、聲帶鱗狀上皮不典型增生、原位癌共608例，期間58例患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率9.5%(58/608)。入排標(biāo)準(zhǔn)為：喉癌及癌前病變根治性R0切除術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)的病例入組，優(yōu)選早期病例；初次手術(shù)切緣陽性術(shù)后復(fù)發(fā)或腫瘤組織過小無法進(jìn)行免疫組化檢測的病例排除。經(jīng)篩選，最終入復(fù)發(fā)組41例。作為對照，將未復(fù)發(fā)的早期喉癌或不典型增生、原位癌病例54例入組對照組，共95例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4μm涂膠白片以備免疫組化檢測。

1.2 免疫組化方法

腫瘤涂膠白片75℃烤箱30分鐘，脫蠟至水。用PTLINK設(shè)備進(jìn)行抗原修復(fù)，97℃烤箱23分鐘，阻斷液室溫封閉10分鐘，PBS沖洗3分鐘；一抗孵育：滴加一抗(p21、p27、survivin、c-Myc、p53和PTEN)工作液，室溫孵育40 分鐘；PBS沖洗3分鐘。二抗室溫孵育20 分鐘，PBS沖洗3分鐘； DAB顯色，清水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。修復(fù)液、阻斷液及二抗等試劑均采用DAKO公司Envision 產(chǎn)品。根據(jù)腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度和比例相乘結(jié)果對免疫組化結(jié)果評分進(jìn)行分組，具體如下：著色腫瘤細(xì)胞比例按<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%和≥75%分為0～4分，著色強(qiáng)度按未著色、淡黃、淺棕和深棕分為0、1、2、3。以二者相乘分?jǐn)?shù)(0～12)，分為4組，陰性組≤1分，弱陽性組2～3分，中陽性組4～7分，強(qiáng)陽性組≥8。若按陰性和弱陽為一組，而中陽和強(qiáng)陽為一組，分為兩組表達(dá)，進(jìn)一步分析。一抗信息詳見表1。

表1 免疫組化抗體列表

Table 1. Immunohistochemistry Antibodies

First antibody (Clone)First antibody incubation timeIncorporatedCategory numberPositive locationp21 (DCS-60.2)40 minsZSGB-BIOZM-0206Nuclearp27 (EP104)40 minsZSGB-BIOZA-0557NuclearSurvivin (EP119)40 minsZSGB-BIOZA-0530Nuclearc-Myc (Y69)40 minsMXBRMA-0664Nuclearp53 (DO-7)40 minsMXBKIT-0010NuclearPTEN (6H2.1)40 minsDAKOM3627Cytoplasm

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)，以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理基本信息

復(fù)發(fā)組全部為男性，平均年齡(65±10.9)歲；聲門上型5例，聲門型36例；病理顯示不典型增生2例，原位癌3例，高、中、低分化者分別為8、22、6例；腫瘤病理T分期：pTis 3例，pT1 22例，pT2 11例，pT3 3例；腫瘤病理N分期：pN0 15例，pN1 7例，pN2 5例，未行淋巴結(jié)清掃14例；吸煙者36例，酗酒者24例，不飲酒或偶飲酒17例。未復(fù)發(fā)組男51例，女3例，平均年齡(65±8.5)歲；病理顯示原位癌24例，高、中、低分化為12、15、3例；腫瘤病理T分期：pTis 24例，pT1 29例，pT2 0例，pT3 1例；腫瘤病理N分期：pN0 53例，pN1 1例；吸煙者50例，酗酒者27例，不飲酒或偶飲酒27例 (詳見表2)。

表2 95例入組患者臨床病理信息

Table 2. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, P?AgeAverage (y)6565>0.05Median(y)6464GenderMale41(100)51(94.4)0.179Female03(5.6)SmokeYes36(87.8)50(92.6)>0.05No5(12.2)4(7.4)Drink alcoholYes24(58.5)27(50.0)>0.05No or a little17(41.5)27(50.0)DifferentiationSquamous CAWell8(19.5)12(22.2)<0.001Intermidiate22(53.7)15(27.8)Poor6(14.6)3(5.6)Cacinoma in situ3(7.3)24(44.4)Atypical hyperplasia2(4.9)0pTTis3(7.3)24(44.4)Non-random selection, not applicableT122(53.7)29(53.7)T211(26.8)0T33(7.3)1(1.9)Atypical hyperplasia2(4.9)0pNN015(36.6)53(98.1)Non-random selection, not applicableN17(17.1)1(1.9)N25(12.2)0NX14(34.1)0SiteSupraglottis5(12.2)42(77.8)0.161Glottis36(87.8)12(22.2)

*Fisher exact test.

2.2 臨床病理與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系

腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤分化相關(guān)，分化差的喉癌復(fù)發(fā)率更高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表2)，具體為中-低分化喉癌復(fù)發(fā)病例28例(60.8%)，未復(fù)發(fā)18例；高分化喉癌復(fù)發(fā)病例8例(40.0%)，未復(fù)發(fā)12例；原位癌復(fù)發(fā)3例(11.1%)，未復(fù)發(fā)24例。因入組病例為非隨機(jī)篩選，未復(fù)發(fā)組主要選擇的是原位癌和早期喉癌，故對于腫瘤病理分期與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)性無法判斷(表2)。對本組病例中的pT1期病理進(jìn)行復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)組對比，未發(fā)現(xiàn)鱗狀細(xì)胞癌的分化與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，因此這一結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證(表3)。無論是95例病例的比較還是51例pT1期的復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)兩組的比較，均未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)與患者性別、年齡、是否吸煙、酗酒及部位相關(guān)(P>0.05， Fisher精確檢驗(yàn))。

2.3. 免疫組化檢測結(jié)果

2.3.1 腫瘤復(fù)發(fā)與c-Myc表達(dá)(圖1A)的相關(guān)性 依據(jù)方法中的免疫組化評分，按陰性、弱到強(qiáng)陽性表達(dá)分為4組(有1例患者的切片中未觀察到腫瘤)，腫瘤的復(fù)發(fā)與c-Myc蛋白表達(dá)強(qiáng)弱相關(guān)，復(fù)發(fā)組病例中36例(87.8%)呈強(qiáng)表達(dá)，而未復(fù)發(fā)組的強(qiáng)表達(dá)比率是64.2%，腫瘤復(fù)發(fā)與c-Myc表達(dá)顯著相關(guān)(P=0.016，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表4)。本組pT1的病例中復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)腫瘤c-Myc的表達(dá)具有同樣結(jié)果(P=0.047，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表6)。

表3 T1期喉癌的臨床病理信息

Table 3. Correlation between Clinical Pathology and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

VariableRecurrence group (%)Nonrecurrence group (%)Correlation, PAge≥6511(50)12(41.4%)0.371<6511(50)17(58.6%)GenderMale22(100)29(100%)Not calculatedFemale00SmokeYes18(81.8)28(96.6)0.669?No4(18.2)1(3.4)Drink alcoholYes13(59.1)15(51.7)0.406No or a little9(40.9)14(48.3)DifferentiationSquamous CAWell6(27.3)12(41.4)0.561?Intermidiate14(63.6)15(51.7)Poor2(9.1)2(6.9)pNN011(50)28(96.6)<0.001?N13(13.6)1(3.4)N23(13.6)0NX5(22.7)0SiteSupraglottis4(18.2)10(34.5)0.165Glottis18(81.8)19(65.5)

*Fisher exact test.

圖1 喉癌及癌前病變免疫組化表達(dá)×100

Figure1.ImmunohistochemicalExpressionofMarkersinLaryngealCarcinomaandPrecancerousLesions(×100)

A. c-Myc, located on nuclear, tumor cells are strong positive; B. Survivin, located on nuclear, tumor cells are median positive; C. PTEN, located on cytoplasm, precancerous lesion cells are weak positive; D. p21, located on nuclear, tumor cells are strong positive; E. p27, located on nuclear, tumor cells are strong positive; F. p53, located on nuclear, tumor cells are strong positive.

2.3.2 腫瘤復(fù)發(fā)與survivin表達(dá)(圖1B)的相關(guān)性 將免疫組化結(jié)果判讀分為兩組，一組為陰性和弱陽，另一組為中陽和強(qiáng)陽，分為兩組表達(dá)，進(jìn)行分析，在95例患者復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)比較中，發(fā)現(xiàn)survivin中-強(qiáng)表達(dá)的比率在復(fù)發(fā)組(24.4%)要低于無復(fù)發(fā)組(44.4%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表5)。在pT1期亦有同樣的結(jié)果趨勢，即在復(fù)發(fā)組無強(qiáng)陽性表達(dá)病例，而未復(fù)發(fā)組20.7%的腫瘤具有強(qiáng)表達(dá)(P=0.003，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表6)。

2.3.3 腫瘤復(fù)發(fā)與PTEN表達(dá)(圖1C)的相關(guān)性 按兩組表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，PTEN在復(fù)發(fā)組僅有1例為中+強(qiáng)表達(dá)(2.4%)，而在未復(fù)發(fā)組中16.7%為中+強(qiáng)表達(dá)，二者間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.024，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)，表5)。

2.3.4 腫瘤復(fù)發(fā)與p21、p27及p53表達(dá)(圖1D～F)的相關(guān)性 喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組腫瘤組織中的p21、p27及p53(有1例患者的切片中未檢測到腫瘤)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4～6)。

表4 免疫組化結(jié)果四級分組結(jié)果與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)性分析

Table 4. Correlation between Immunohistochemical Results (4 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P p21011(26.8)13(24.1)0.221111(26.8)8(14.8)216(39.0)22(40.7)33(7.4)11(20.4)Total41(100)54(100)c-Myc02(4.9)2(3.8)0.016?12(4.9)4(7.5)21(2.4)13(24.5)336(87.8)34(64.2)Total41(100)53(100)p53018(43.9)21(39.6)0.359?15(12.2)2(3.8)24(9.8)5(9.4)314(34.1)25(47.2)Total41(100)53(100)p2707(17.1)11(20.4)0.902112(29.3)13(24.1)211(26.8)17(31.5)311(26.8)13(24.1)Total41(100)54(100)PTEN035(85.4)38(70.4)0.058?15(12.2)7(13.0)208(14.8)31(2.4)1(1.9)Total41(100)54(100)Survivin012(29.3)6(11.1)0.072?119(46.3)24(44.4)28(19.5)17(13.0)32(4.9)7(13)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表5 免疫組化結(jié)果兩級分組結(jié)果與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)性分析

Table 5. Correlation between Immunohistochemical Results (2 Groups) and Tumor Recurrence in 95 Cases of Laryngeal Carcinoma

MarkersScores (2 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, Pp210+122(53.7)21(38.9)0.1102+319(46.3)33(61.1)Total41(100)54(100)c-Myc0+14(9.8)6(11.3)0.542?2+337(90.2)47(88.7)Total41(100)53(100)p530+123(56.1)23(43.4)0.1552+318(43.9)30(56.6)Total41(100)53(100)p270+119(46.3)24(44.4)0.5092+322(53.7)30(55.6)Total41(100)54(100)PTEN0+140(97.6)45(83.3)0.024?2+31(2.4)9(16.7)Total41(100)54(100)Survivin0+131(75.6)30(55.6)0.0352+310(24.4)24(44.4)Total41(100)54(100)

*Fisher exact test.

表6 T1期喉癌的免疫組化結(jié)果與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)性分析

Table 6. Correlation between Immunohistochemical Results and Tumor Recurrence in T1 Laryngeal Carcinoma Patients

MarkersScores (4 groups)Recurrence (%)Nonrecurrence (%)Correlation, P?p2107(31.8)7(24.1)0.65315(22.7)5(17.2)29(40.9)13(44.8)31(4.5)4(13.8)c-Myc02(9.1)2(6.9)0.04711(4.5)1(3.4)208(27.6)319(86.4)17(58.6)p53010(45.5)11(37.9)0.71012(9.1)1(3.4)22(9.1)2(6.9)38(36.4)15(51.7)Survivin06(27.3)00.003110(45.5)15(51.7)26(27.3)8(27.6)306(20.7)p2705(22.7)6(20.7)0.77217(31.8)9(31.0)25(22.7)10(34.5)35(22.7)4(13.8)pTEN017(77.3)26(89.7)0.06314(18.2)1(3.4)202(6.9)31(4.5)0

*Fisher exact test.

3 討 論

喉癌或癌前病變術(shù)后或根治性放療后復(fù)發(fā)并不少見，來自國家癌癥中心和廣東省人民醫(yī)院的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率分別為20.2%[1]和23.4%[2]。而本組數(shù)據(jù)復(fù)發(fā)率約為9.5%，低于文獻(xiàn)報(bào)道，這可能與入組病例為3年內(nèi)復(fù)發(fā)病例和R0切除，以及與多學(xué)科診治的開展、手術(shù)設(shè)備和技術(shù)的提升等有關(guān)。喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者的疾病進(jìn)展快、治療效果欠佳，解決這一問題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是如何對術(shù)后復(fù)發(fā)提早預(yù)警。從臨床角度分析，多篇文獻(xiàn)顯示手術(shù)切緣陽性、分化程度、臨床分期及吸煙或飲酒的狀態(tài)等與喉癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，與年齡、性別無顯著相關(guān)[1-2]。本組復(fù)發(fā)患者均為男性，可能與喉癌有明顯的男性傾向，并且男性中吸煙者和飲酒者的比例更高有關(guān)。本組結(jié)果亦提示，R0切除后腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤組織學(xué)分化程度存在相關(guān)性。

腫瘤分化程度與復(fù)發(fā)相關(guān)，分化越差，腫瘤復(fù)發(fā)率越高，這一結(jié)果在文獻(xiàn)中亦有相同報(bào)道[1-3]。腫瘤分化差與預(yù)后不良有關(guān)，與高分化的患者相比，低分化者的3年存活率明顯降低(45.1%vs88.5%)[4]。與喉癌預(yù)后相關(guān)的臨床病理因素還包括浸潤前沿腫瘤生長方式、血管神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌侵犯被膜外等[5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，喉癌手術(shù)切緣組織中survivin陽性者的局部復(fù)發(fā)率明顯高于陰性者(75.0%vs22.7%,P<0.05)[6]；本研究顯示腫瘤組織survivin的強(qiáng)表達(dá)者復(fù)發(fā)率反而低。雖觀察部位不同，但均顯示survivin的表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)相關(guān)，提示該基因改變對腫瘤復(fù)發(fā)判斷可能具有一定意義。有文獻(xiàn)報(bào)道，survivin蛋白的高表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)情況等臨床病理特征有相關(guān)性，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[7]。上述結(jié)果與survivin的作用機(jī)制相關(guān)。Survivin作為凋亡抑制因子對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起一定作用，其主要通過抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7的活性或與周期蛋白激酶CDK4相互作用而阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。

c-Myc是一種包含亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子，可以參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控[9]。本研究顯示c-Myc的表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤復(fù)發(fā)率越高。國內(nèi)亦有無顯著差異的研究報(bào)道[10]。c-Myc與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性仍存爭議。然而，對c-Myc的結(jié)構(gòu)和功能的研究及靶點(diǎn)治療為喉癌治療提供了新希望[11-12]。

PTEN作為抑癌基因，在腫瘤細(xì)胞浸潤、血管發(fā)生及腫瘤轉(zhuǎn)移中起一定抑制作用[13]。我們的結(jié)果顯示，喉癌腫瘤復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組組織中PTEN的強(qiáng)表達(dá)情況存在差異(2.4%vs16.7%)，提示PTEN的強(qiáng)表達(dá)對腫瘤復(fù)發(fā)具有一定抑制作用(P=0.024)。另有研究對喉癌切緣組織行PTEN的檢測，顯示PTEN陽性者局部復(fù)發(fā)率明顯低于陰性者(37.1%vs100.0%,P<0.05)[6]。PTEN在腫瘤組織和切緣組織的表達(dá)降低均顯示與復(fù)發(fā)相關(guān)，提示可作為預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)的分子指標(biāo)。

野生型p53是重要的抑癌基因之一，突變型p53基因則發(fā)揮著原癌基因的作用，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]，其蛋白半衰期長，可通過免疫組織化學(xué)方法檢出[15]。在多數(shù)腫瘤中，可發(fā)現(xiàn)突變型p53蛋白的表達(dá)[16]。有研究顯示喉癌手術(shù)切緣中p53蛋白陽性與術(shù)后局部復(fù)發(fā)明顯相關(guān)[10]。p21與p27蛋白是細(xì)胞周期抑制蛋白，在細(xì)胞周期的調(diào)控中起重要作用[17-18]。p21基因存在p53依賴性和非依賴性兩種途徑，其表達(dá)與腫瘤預(yù)后關(guān)系的臨床研究報(bào)道也不盡相同[19]，與喉癌復(fù)發(fā)相關(guān)性的報(bào)道也有爭議[20-21]。p27蛋白表達(dá)在惡性腫瘤中的表達(dá)明顯低于良性病變，其表達(dá)減少或缺失與患者的不良預(yù)后可能有一定關(guān)系[18,22]。而Korkmaz等[21]的研究結(jié)果顯示，P27的高表達(dá)與早期喉癌復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究中，上述蛋白的表達(dá)與喉癌或癌前病變術(shù)后復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)性(P>0.05)，說明上述基因蛋白表達(dá)在該領(lǐng)域還有待進(jìn)一步研究，目前尚不能作為喉癌復(fù)發(fā)預(yù)警的標(biāo)志物。

綜上所述，影響喉癌或癌前病變術(shù)后復(fù)發(fā)是多因素的，本研究綜合臨床病理因素及熱點(diǎn)腫瘤標(biāo)志物的分析，提示c-Myc、survivin及PTEN的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)存在一定相關(guān)性，為患者的預(yù)后預(yù)警提供一定的幫助。

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