于印霄，王小卉，陳雪橋，劉元安

(北京郵電大學(xué)電子工程學(xué)院 安全生產(chǎn)智能監(jiān)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100876)

1 引言

光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy,PDT)是一種基于光敏藥物吸光產(chǎn)生高活性氧(主要是單線態(tài)氧，1O2)、進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法[1-2]。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧水平很低，單線態(tài)氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡中，一旦打破平衡，將引起一系列生理反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-4]。因此，有效地檢測(cè)單線態(tài)氧濃度變化對(duì)于評(píng)估光動(dòng)力治療效果具有重要的意義。

目前常見(jiàn)的單線態(tài)氧檢測(cè)方法主要有電子順磁共振法(ESR)、直接測(cè)定法、分光光度法和熒光光度法等。ESR方法靈敏度高，選擇性好，但測(cè)定的ESR信號(hào)受到共存離子、溶劑等條件的影響，檢測(cè)誤差較大，而且儀器的操作程序相對(duì)復(fù)雜；直接測(cè)定法對(duì)生物體無(wú)侵害，選擇性高，但靈敏度低，檢出信號(hào)弱，無(wú)法用于低濃度1O2的檢測(cè)；分光光度法和熒光光度法選擇性好，但大多探針?biāo)苄暂^差，不利于生物體系內(nèi)1O2的測(cè)定[5]。近年來(lái)，具有高靈敏度和良好水溶性的單線態(tài)氧探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。單線態(tài)氧熒光探針(Singlet oxygen sensor green,SOSG)具有較好的水溶性，可以間接測(cè)量1O2濃度[6-7]，但其自身在紫外光照下會(huì)產(chǎn)生1O2，且細(xì)胞吞噬效率較低，因此導(dǎo)致其在定量檢測(cè)1O2和亞細(xì)胞水平應(yīng)用方面存在一定的局限性[8-10]。1,3二苯基異苯并呋喃(DPBF)是一種常用的1O2指示劑[11]，能快速與1O2進(jìn)行反應(yīng)[12-13]，對(duì)少量1O2具有比SOSG更高的敏感性。Ping等[14]將DPBF包埋于納米顆粒中，通過(guò)共聚焦顯微鏡對(duì)吞噬納米顆粒的癌細(xì)胞進(jìn)行熒光成像，根據(jù)熒光成像強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)光動(dòng)力治療過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧的變化。在光動(dòng)力治療領(lǐng)域，納米探針正逐漸用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)1O2[15]，通過(guò)生物兼容納米顆粒負(fù)載非水溶性的單線態(tài)氧檢測(cè)劑，可以拓展其在生物檢測(cè)方面的應(yīng)用?？傊?，我們需要發(fā)展更多新型、簡(jiǎn)便且靈敏度較高的水溶性單線態(tài)氧檢測(cè)材料。

本文首先基于再沉淀法制備了二氧化硅包覆DPBF的單線態(tài)氧納米探針。其中采用高分子材料聚苯乙烯(PS)和十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)作為基質(zhì)，DTS水解在納米顆粒表面形成二氧化硅殼層，DPBF隨機(jī)地分散于納米顆粒內(nèi)部，即形成包覆DPBF的納米顆粒[16]。然后選擇吲哚菁綠(ICG)作為光敏劑，采用808 nm激光輻照，通過(guò)觀察納米探針的吸收峰強(qiáng)度變化檢測(cè)單線態(tài)氧的產(chǎn)生[17-19]。隨著激光輻照劑量的增加，納米探針的吸收峰逐漸被猝滅，表明該納米探針對(duì)單線態(tài)氧具有高靈敏度，可以用來(lái)監(jiān)測(cè)光動(dòng)力治療中的單線態(tài)氧濃度變化。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)中所需要的化學(xué)試劑：1,3 二苯基異苯并呋喃(DPBF)、聚苯乙烯(PS)、十二烷基三甲氧基硅烷、四氫呋喃(THF)均購(gòu)自Sigma-Aldrich，吲哚菁綠(ICG)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自百靈威科技有限公司，氨水購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上所有試劑購(gòu)買后配成溶液直接使用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均用18 MΩ/cm的去離子水。

2.2 樣品制備方法與步驟

采用再沉淀法制備包覆DPBF的單線態(tài)氧納米探針，首先配置DPBF(500×10-6g/mL)、PS(2000×10-6g/mL)和DTS(2000×10-6g/mL)的THF溶液；待溶液充分溶解后，分別配置DPBF、PS和DTS質(zhì)量比為10∶40∶50、15∶35∶50、20∶30∶50和25∶25∶50的混合溶液，并通過(guò)添加THF使其最終濃度為400×10-6g/mL；然后取0.5 mL混合溶液在超聲振蕩條件下迅速注入到8 mL的去離子水溶液中，并且調(diào)節(jié)溶液的pH值為9；最后將懸浮液靜置2 h，并于去離子水中透析24 h以除去有機(jī)溶劑四氫呋喃，即得到包覆DPBF的納米顆粒。

2.3 納米顆粒表征方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中納米顆粒的吸收光譜由日本分光株式會(huì)社生產(chǎn)的型號(hào)為V-550 的紫外分光光度計(jì)測(cè)得；樣品的透射電子顯微鏡成像由日立公司生產(chǎn)型號(hào)為JEM 1400EX的透射電子顯微鏡測(cè)得；利用馬爾文公司生產(chǎn)的型號(hào)為Nano ZS90的激光粒度儀對(duì)納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射粒徑進(jìn)行表征。

3 結(jié)果及討論

3.1 單線態(tài)氧納米探針的制備與表征

基于再沉淀法制備二氧化硅包覆DPBF的單線態(tài)氧納米探針。在超聲條件下把聚苯乙烯、硅氧烷和DPBF的混合溶液注入到pH=9的溶液中；注入后疏水的聚苯乙烯和硅氧烷為避免與水接觸，向內(nèi)折疊成球形納米顆粒，DPBF隨機(jī)地分散于納米顆粒中；硅氧烷基團(tuán)在堿性環(huán)境下迅速發(fā)生水解和縮聚,在納米顆粒表面形成二氧化硅殼層，可以有效地將DPBF與水隔離，進(jìn)而起到保護(hù)作用。納米探針的形貌通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行表征，如圖1(a)所示，納米顆粒分布較為均勻，分散性良好，呈球形，表面光滑，粒徑約為200 nm。圖1(b)是馬爾文粒度儀測(cè)得的動(dòng)態(tài)光散射粒徑，納米顆粒的粒徑主要分布在200 nm左右，與透射電鏡測(cè)得的粒徑結(jié)果一致。放置48 h以后，納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射粒徑略微增加，約為230 nm左右(圖1(c))，證明其具有較好的穩(wěn)定性。圖2為DPBF分別溶于DMSO溶液中和封裝于納米顆粒內(nèi)的吸收光譜。溶解于DMSO中的DPBF吸收峰位于410 nm左右，而納米顆粒中的DPBF吸收峰則位于426 nm，吸收峰紅移是由于DPBF的局域環(huán)境發(fā)生改變引起的。

圖1 (a)單線態(tài)氧納米探針的TEM圖像;(b)單線態(tài)氧納米探針的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布;(c)放置48 h后，納米探針的粒徑分布。Fig.1 (a)TEM images of singlet oxygen nanoprobes.(b)Histogram of hydrodynamic diameter data measured by dynamic light scattering.(c)Hydrodynamic diameter recorded after 48 h.

圖2 DPBF溶于DMSO溶液中和封裝于納米顆粒內(nèi)的吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of DPBF dissolved in DMSO aqueous solutions and encapsulated in nanoparticles

3.2 單線態(tài)氧敏感性檢測(cè)

為了選擇最佳的DPBF摻雜濃度以制備高靈敏度的單線態(tài)氧納米探針，我們分析了封裝不同比例DPBF(10%、15%、20%、25%)的DPBF-NPs的吸收光譜隨激光輻照的變化情況(圖3)。隨著DPBF濃度的增大，DPBF-NPs位于426 nm的吸收峰逐漸增強(qiáng)。為測(cè)試其單線態(tài)氧敏感性，取2 mL DPBF-NPs分散溶液與20 μL的0.1 mg/mL的ICG溶液混合，然后利用808 nm激光器進(jìn)行激光輻照，即獲得DPBF吸收強(qiáng)度隨輻照時(shí)間變化的曲線。如圖4(a)所示，隨著激光輻照時(shí)間的增加，DPBF和ICG的吸收峰逐漸降低。輻照12 min以后，DPBF的吸收峰幾乎完全猝滅。表明ICG被光激發(fā)后產(chǎn)生單線態(tài)氧，并與納米顆粒中的DPBF反應(yīng)，致使其吸收逐漸降低[20-23]。為了描述不同摻雜濃度的納米探針對(duì)單線態(tài)氧的敏感性，我們分析375～475 nm之間的吸收峰面積變化來(lái)定量表征DPBF的猝滅效果。如圖4(b)所示，10%-DPBF-NPs中DPBF含量相對(duì)較少，輻照后猝滅率約為70%；15%-DPBF-NPs在激光照射12 min之后，猝滅率達(dá)到86%。表明更多比例的DPBF與1O2發(fā)生了反應(yīng)，15%-DPBF-NPs對(duì)單線態(tài)氧具有良好的敏感性。而對(duì)于20%-DPBF-NPs，由于其DPBF摻雜濃度相對(duì)較高，猝滅率低于15%-DPBF-NPs。

為了研究在不同輻照功率下DPBF-NPs對(duì)單線態(tài)氧的敏感性，我們進(jìn)一步選擇50 mW和210 mW的激光進(jìn)行輻照，然后表征其吸收光譜變化。如圖5(a)所示，50 mW激光輻照12 min后，DPBF吸收強(qiáng)度猝滅率約為40%；采用210 mW激光輻照后，可能由于功率過(guò)高，破壞了光敏劑的熒光基團(tuán)，致使ICG產(chǎn)生單線態(tài)氧的效率變低，12 min后猝滅效率比15%-DPBF-NPs略低，約為75%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選擇合適的激光功率可以優(yōu)化DPBF-NPs對(duì)單線態(tài)氧的檢測(cè)效果。為了分析單線態(tài)氧納米探針的光穩(wěn)定性，我們使用130 mW的激光輻照15%-DPBF-NPs。如圖5(b)所示，DPBF的吸收峰變化微弱，激光輻照12 min后僅下降約2%，證明DPBF具有比較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。由于ICG存在光熱現(xiàn)象，在持續(xù)的激光輻照下，納米探針的環(huán)境溫度會(huì)發(fā)生變化。因此，我們分析了納米探針在不同溫度下的吸收光譜，可以看出當(dāng)溫度由20 ℃升高到40 ℃時(shí)，DPBF的峰值下降約10%，對(duì)比單線態(tài)氧的猝滅效果，溫度對(duì)納米探針的影響較弱。

圖3 摻雜不同濃度DPBF的納米顆粒的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of nanoparticles doped with different concentrations of DPBF

圖4 (a)15%-DPBF-NPs在130 mW激光輻照下的吸收光譜，每輻照3 min后進(jìn)行吸收光譜表征；(b)不同DPBF摻雜濃度的納米探針的吸收峰猝滅。Fig.4 (a)Absorption spectra of 15%-DPBF-NPs under laser irradiation.After 3 min of irradiation,the absorption spectra is tested.(b)Absorption peak quenching of nanoprobes doped with different DPBF concentrations after laser irradiation.

圖5 (a)在不同功率的激光輻照下,單線態(tài)氧敏感性的柱狀圖；(b)15%-DPBF-NPs在130 mW激光輻照下的吸收光譜；(c)在不同溫度下，15%-DPBF-NPs吸收峰的變化趨勢(shì)圖。Fig.5 (a)Histogram of singlet oxygen sensitivity of nanoprobes under laser irradiations with different power.(b)Absorption spectra of 15%-DPBF-NPs irradiated by 130 mW laser.(c)Trends of absorption peak of 15%-DPBF-NPs at different temperatures.

為分析單線態(tài)氧納米探針的檢測(cè)靈敏度，我們分別使用溶于DMSO中的DPBF溶液和封裝DPBF的熒光納米探針對(duì)ICG的光動(dòng)力現(xiàn)象進(jìn)行檢測(cè)。首先取20 μL的0.5 mg/mL DPBF溶液與微量ICG混合，待混合均勻后進(jìn)行激光輻照，然后表征吸收光譜。如圖6所示，隨著輻照時(shí)間的增加，溶于DMSO中的DPBF猝滅率僅約為10%。這是因?yàn)镈PBF溶解于有機(jī)溶劑，在水中的溶解性差，單線態(tài)氧不易與DPBF接觸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致水溶液中1O2的檢測(cè)靈敏度較低[24]。因此在光動(dòng)力治療過(guò)程中，將單線態(tài)氧檢測(cè)劑封裝于納米顆粒中制成水溶性較好的納米探針，能夠優(yōu)化單線態(tài)氧的檢測(cè)效果。

圖6 溶解于DMSO中的DPBF與DPBF-NPs對(duì)單線態(tài)氧的敏感性對(duì)比Fig.6 Comparison of the sensitivity of DPBF in DMSO and DPBF-NPs to singlet oxygen

4 結(jié)論

本文從光動(dòng)力治療出發(fā)，通過(guò)簡(jiǎn)單易制的方法制備了一種新型的單線態(tài)氧納米探針。該探針具有核殼型結(jié)構(gòu)，在二氧化硅包覆的核心部分摻雜DPBF分子，有效提高了探針?lè)肿拥乃苄?，進(jìn)而提高了納米探針的單線態(tài)氧靈敏度。通過(guò)分析不同DPBF摻雜濃度和激光輻照功率，發(fā)現(xiàn)在130 mW激光輻照下，15%-DPBF-NPs的吸收峰有明顯的下降，猝滅率能夠達(dá)到86%。該單線態(tài)氧納米探針具有較小粒徑、良好水溶性和高的靈敏度，在光動(dòng)力治療領(lǐng)域具有很廣闊的應(yīng)用前景。