劉揚 李彥芹 馬秀清 解立新

中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸科,北京100853

肺曲霉病是感染曲霉菌后引起的一種慢性疾病,可侵犯皮膚、黏膜、鼻腔、肺、神經等,在各種曲霉中主要以煙曲霉為主。根據病原菌的致病力可分為致病性真菌和條件致病性真菌。致病性真菌本身具有致病性,條件致病性真菌致病性低,通常不感染正常人,但正常人大量接觸后或免疫功能低下者容易感染,煙曲霉就是其中的一種條件致病菌。根據我國目前的流行病學資料,在非血液惡性疾病患者中肺真菌病主要有肺曲霉病 (37.9%)、肺念珠菌病 (34.2%)、肺隱球菌病 (15.6%)、肺孢子菌病 (4.8%)、肺毛霉病 (2.1%)、肺馬爾尼菲藍狀菌病和組織胞漿菌病[1]。可見肺曲霉病在非血液惡性疾病患者中占有很大的比重,應該受到重視。慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)是一種難治的肺部疾病,發(fā)病比較緩慢,其進程往往持續(xù)3個月以上,常合并其他呼吸疾病,如不積極治療,5 年病死率較高(75%～80%),因此需提高臨床醫(yī)師對CPA 的全面認識,以期盡早明確診斷,并給予恰當治療,以降低其病死率。

目前上市的抗體檢測試劑盒,能檢測血清曲霉特異性IgE類抗體,僅對變應性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)有診斷價值。國內天津丹娜公司正在開展曲霉IgG類抗體檢測的臨床實驗,試圖通過IgG 檢測提示疾病的發(fā)生及進展。過去人們對曲霉抗體檢測的研究并不清楚,隨著近年來對侵襲性曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)研究的深入,尤其是對CPA 認識的加深,以及GM 試驗對CPA 的診斷效果不盡如人意,科研人員越來越重視曲霉菌抗體檢測在IPA 尤其是CPA 診斷中的作用[2]。在2015年出版的歐洲CPA 診斷和治療的臨床指南中[3],特別強調了曲霉IgG 抗體檢測、曲霉IgM 抗體檢測和曲霉IgE抗體檢測在CPA 診斷中的重要作用。2016年更新的美國感染病學會(Infectious Disease Society of America,IDSA)曲霉病診斷與處置指南中,更是強調了曲霉IgG 抗體檢測是慢性空洞性肺曲霉病診斷中最靈敏的微生物學方法[4]。因此,為了評估其臨床診斷價值,及時的監(jiān)控患者病情并進行及時診治,需要盡早開展此項檢測工作。

1 材料與方法

1.1 材料來源 2017～2018年在解放軍總醫(yī)院呼吸科實驗室復查血清煙曲霉IgG 抗體的患者血清42例,年齡 (51.8±14.5)歲,年齡范圍17～85歲,男23例,女19例。血清保存在-80 ℃冰箱。本項目已經得到解放軍總醫(yī)院倫理委員的審查和批準(S2017-015-01)。

1.2 實驗試劑 天津丹娜公司生產的煙曲霉IgG抗體檢測試劑盒。

1.3 實驗儀器 北方同正生物技術發(fā)展公司HQ-60旋渦混合器;北京醫(yī)用離心機廠LG10-2.4A高速離心機;美國Bio Tek Instruments,Inc.ELX800全自動酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 血清煙曲霉IgG 抗體水平的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法,操作嚴格按照試劑盒說明書進行：(1)試驗前將試劑盒取出,置于室溫 (20～25 ℃)達30 min;(2)打開裝有酶標板的密封袋R1,將暫不用的板條放回密封袋內封好,保存在2～8 ℃;(3)配制工作洗滌液,濃縮洗液稀釋20倍 (1份濃縮液加19 份的無菌去離子水或超純水),稀釋后的工作洗滌液可在2～8 ℃保存2周。若濃縮洗液出現(xiàn)結晶,請30 ℃水浴溶解后使用;(4)樣本稀釋,待測樣本需用樣本稀釋液稀釋1 000倍 (1份樣本加999份樣本稀釋液);(5)留第一孔做空白對照,其余各孔依次加入煙曲霉IgG抗體標準品、質控品A、質控品B 和稀釋后的血清樣本各100μl;(6)貼上封板膜,樣品于37 ℃條件下孵育 (60±5)min; (7)洗滌,揭開封板膜,洗滌酶標板。每孔每次加入不少于300μl的洗滌液,靜置40 s后將酶標板孔內液體除去,在吸水紙上反復拍打去除殘留液體,重復上述洗滌操作,共洗滌3次;(8)每孔加入100μl酶標抗體;(9)貼上封板膜,在37 ℃條件下孵育 (30±1)min;(10)同步驟 (7);(11)每孔加入底物溶液100μl; (12)在37 ℃條件下孵育15 min,避光;(13)每孔加入50μl終止液,加樣順序與加入底物溶液的順序一致,混勻;(14)加入終止液后,在5 min內于酶標儀450 nm 波長處讀吸光度值 (OD 值)。

1.4.2 結果判讀 煙曲霉IgG 抗體滴度≥120 AU/ml,則定為陽性;煙曲霉IgG 抗體滴度在80～120 AU/ml,定為可疑陽性;煙曲霉IgG抗體滴度＜80 AU/ml,則定為陰性。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理數據。兩組定量數據之間的比較用t檢驗,結果以±s表示,率的比較用χ2檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 檢測陽性率變化 42例患者分別在3個月內復檢煙曲霉特異性IgG 抗體。除外16例陰性患者及5例未抗真菌治療患者,余下陽性 (16例)和可疑陽性 (5例)患者21例給予伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑等抗真菌藥物治療。其中,陽性患者治療后陽性比例降至68.75%,其余31.25%轉為可疑陽性 (18.75%)或陰性 (12.5%);但是可疑陽性患者治療后,可疑陽性的比例占60%,陰性比例占20%,陽性比例占20%。陽性或者可疑陽性患者治療后轉陰比例均呈明顯增高的趨勢,患者對抗真菌治療比較敏感;同時也提示該試劑盒所測陽性患者血清煙曲霉IgG 的變化能夠反映疾病的發(fā)生與發(fā)展進程。

2.2 抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 水平的變化分別對16例陽性和5例可疑陽性患者血清煙曲霉IgG 水平進行分析,抗真菌治療前后,分別用配對t檢驗統(tǒng)計分析?？拐婢委熀箨栃曰颊哐鍩熐笽gG 水平顯著下降 [(243.00±131.73)AU/ml vs(141.11±46.96)AU/ml,t=2.910,P＜0.01],差異有顯著統(tǒng)計學意義;可疑陽性患者治療前后血清煙曲霉IgG 水平無顯著變化。表明,抗真菌治療能夠顯著降低CPA 患者血清中煙曲霉IgG 的水平,但是對可疑陽性患者效果不明顯(表1)。

表1 治療前后煙曲霉IgG 水平比較 (AU/ml,±s)

表1 治療前后煙曲霉IgG 水平比較 (AU/ml,±s)

注：與治療前比較,aP ＜0.05

組別 例數 治療前 治療后陽性組 16 243.00±131.73 141.11±46.96a可疑陽性組 5 97.39±13.55 99.10±30.16 t值 2.425 1.866P 值 0.026 0.078

2.3 陽性患者抗真菌治療前后血清煙曲霉IgG 檢測陽性率比較 治療前16例患者血清煙曲霉IgG水平＞120 AU/ml,治療后11例＞120 AU/ml,5例＜120 AU/ml?？ǚ綑z驗結果表明,抗真菌治療后煙曲霉IgG 陽性率顯著下降 (χ2=5.926,P=0.015)。對血清煙曲霉IgG 陽性患者進行抗真菌治療切實有效,能夠顯著降低患者血清煙曲霉IgG的陽性率。

2.4 臨床診斷肺曲霉菌感染患者抗真菌治療前后IgG 水平的比較 16 例陽性患者血清煙曲霉IgG水平＞120 AU/ml,其中12例臨床診斷為肺曲霉菌感染,對其抗真菌治療前后血清IgG 水平用配對t檢驗統(tǒng)計分析。結果表明,抗真菌治療前IgG水平為 (263.13±146.50)AU/ml,治療后煙曲霉IgG 水平為 (150.02±49.37)AU/ml,呈顯著下降 (t=2.530,P＜0.01)。并且,治療前肺曲霉菌感染患者臨床癥狀如體質量減輕、全身乏力、盜汗和食欲下降、及慢性咳痰、呼吸困難、胸部不適的患者 (9例)占比75%,抗真菌治療后占比 (4例)33.33%,呈顯著下降 (χ2=4.200,P=0.041)。但是抗真菌治療后患者3 個月復查肺CT,僅有2例影像學病灶較治療前縮小,10例患者治療前后影像學病灶吸收無顯著變化。臨床診斷肺曲霉菌感染患者檢測血清中IgG 水平變化的指導意義優(yōu)先于影像學結果。

3 討論

CPA 的診斷需同時滿足以下條件： (1)胸部影像學的特征性表現(xiàn);(2)曲霉菌感染的直接證據(顯微鏡或活組織培養(yǎng))或曲霉菌免疫反應陽性;(3)排除其他疾病,病程超過3個月[3]。曲霉菌免疫反應中比較常見的就是特異性IgG 抗體的檢測。IgG 是血清主要的抗體成分,約占血清Ig的75%,其中40～50%分布于血清中,其余分布在組織中。在5種免疫球蛋白中,IgG 生成的相對較晚,其持續(xù)時間也是最長的,免疫球蛋白是機體受抗原 (如病原體)刺激后產生的,其主要作用是與抗原起免疫反應,生成抗原-抗體復合物,從而阻斷病原體對機體的危害,使病原體失去致病作用,在機體免疫中起到保護作用,能有效抵抗某些感染性疾病。外源性真菌侵入肺部,引起肺的局部的炎癥反應,局部與整體互相影響,血清中煙曲霉IgG 抗體水平升高,提示患者煙曲霉菌感染,肺部真菌感染后不斷刺激機體產生炎癥反應,其IgG 抗體一直處于比較高的水平,其濃度也會持續(xù)很長一段時間。

與真菌抗原檢測相比,真菌血清特異性抗體檢測的研究和臨床應用相對滯后,其主要原因是過去人們認為抗體檢測的特異性較差,不能區(qū)分是體內定植還是感染;而機會性真菌感染常發(fā)生在機體免疫功能低下的人群,難以產生足夠量的抗體,易發(fā)生假陰性[5]。但是近年來的研究表明,定植和感染的患者其特異性抗體水平存在顯著差異;而存在免疫缺陷的患者也可以產生足夠的抗體水平從而用于肺部真菌感染的診斷[6]。同時,隨著人們對CPA認識的加深,真菌特異性抗體檢測已經成為診斷的重要方法。血GM 試驗廣泛用于IPA 的診斷,但在CPA 患者中其陽性率不高。Shin等[7]對確診為CPA 的168例患者進行研究,發(fā)現(xiàn)血GM 試驗陽性率為23%,其敏感度為23%,特異度為85%,認為血GM 試驗不能用于CPA 的血清學診斷。本研究中,CPA 患者治療前后血清煙曲霉IgG 抗體陽性率的變化能顯示CPA 的發(fā)生與發(fā)展進程,抗真菌治療能夠顯著降低CPA 患者血清中煙曲霉IgG 的水平,但是對可疑陽性患者效果不明顯 (表1),這和患者的臨床癥狀減輕或消失相符。本研究顯示,可疑陽性患者經抗真菌治療后其煙曲霉IgG抗體水平與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義,以煙曲霉IgG 抗體滴度120 AU/ml為界,單獨分析16例陽性治療前后的情況,治療后與治療前差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),顯示抗真菌治療對血清煙曲霉IgG 抗體滴度＞120 AU/ml的患者顯著,可疑陽性組沒有明顯效果,也就是說可疑陽性組患者抗真菌治療效果不好,這類患者可用藥也可不用。12例臨床診斷煙曲霉菌感染患者抗真菌治療后,臨床癥狀較治療前減輕,但是CPA 患者病程往往較長,病灶吸收緩慢,本研究12例臨床診斷患者于3個月后復查肺CT,影像學結果顯示僅有2例患者病灶較之前吸收縮小,其余10例病灶吸收無明顯變化,本研究結果提示臨床診斷煙曲霉感染患者的血清學結果優(yōu)先于影像學結果。

本研究中煙曲霉特異性IgG 抗體水平一定程度上提示了疾病進展的程度,該試劑盒所測陽性患者血清煙曲霉IgG 陽性率的變化能夠反映疾病的發(fā)生與發(fā)展進程。同時抗真菌治療后,患者臨床癥狀明顯減輕,提示抗真菌治療成功,其抗體水平也會相應降低,進一步證實煙曲霉特異性抗體檢測在CPA 感染中的意義,為CPA 患者的早期臨床診斷及疾病的進展有一個很好的提示作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突