張倩茹 凌 蕾 何芋岐 秦 琳 杜藝玫 楊夢(mèng)婷 姜 媛 譚道鵬

遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563099

艾納香(BlumeabalsamiferaDC.) 又名大風(fēng)艾、冰片艾，苗藥名檔窩凱，為菊科多年生草本植物，廣泛分布于廣西、貴州、云南、廣東等省[1]。具有祛風(fēng)除濕，溫中止瀉，活血解毒的功效，作為苗藥常用于治療風(fēng)寒感冒、頭風(fēng)痛、風(fēng)濕痹痛、寒濕瀉痢、跌撲傷痛等癥[2]。艾納香除作為民族藥直接用于臨床外，還是天然冰片——艾片(左旋龍腦)的主要提取原料[3]。化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，艾納香含有揮發(fā)油類、黃酮類、倍半萜類、酚酸類等多種成分[4-8]。多糖是生物體中廣泛存在的物質(zhì)，現(xiàn)今植物多糖研究日益受到關(guān)注，許多植物多糖被發(fā)現(xiàn)具有很好的生物活性，如香菇多糖能夠抗腫瘤[9-10]，人參多糖[11-12]能提高免疫力等。目前對(duì)艾納香中的多糖類成分研究較少，劉剛等[13]通過蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水楊酸(DNS)法對(duì)艾納香中的糖類成分含量進(jìn)行了測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)多糖含量測(cè)定應(yīng)用更廣泛的苯酚-硫酸法對(duì)艾納香中多糖含量進(jìn)行測(cè)定，以期為今后艾納香藥材全面化學(xué)成分研究及系統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 紫外-可見分光光度計(jì)(島津UV-2401PC)，DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋( 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DZF-6030A 型真空干燥箱 ( 上海恒科學(xué)儀器有限公司)；BT125D 電子天平( 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；葡萄糖對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0892-200716)；其它試劑，苯酚(分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20140122)；硫酸(分析純，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司，批號(hào)20140101)，水為蒸餾水。

1.2 樣品來源 艾納香藥材購(gòu)自貴州苗藥生物科技有限公司，經(jīng)作者鑒定為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera(L.) DC. 的干燥葉及嫩枝。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取葡萄糖對(duì)照品溶液、供試品溶液和水各1.0 mL于量瓶中，各加5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱顯色30 min，迅速冷卻至室溫，定容，混勻，在紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和供試品溶液在490 nm處均有最大吸收，并參考文獻(xiàn)[8]，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，置50 mL量瓶中加水溶解，定容，搖勻，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.5、 1.0、 2.5、 3.0、 4.0、 5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得濃度為0.01、0.02、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和水1.0 mL置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱30 min后取出，迅速冷卻至室溫，于490 nm處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y= 7.1971x+ 0.0174，R2= 0.9967。結(jié)果表明，葡萄糖在0.011～0.108 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見圖1)。

2.4 供試品中多糖含量測(cè)定 取艾納香藥材粉末0.50 g，精密稱定，加乙醚100 mL，加熱回流 0.5 h，放冷，棄去乙醚溶液，殘?jiān)猛L(fēng)櫥內(nèi)揮盡乙醚后，加水 200 mL，加熱回流 2.0 h，趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，定容至250 mL，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置具塞試管中，加水 1.0 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入 5% 苯酚溶液 1.0 mL”起，依次測(cè)定吸光度，并依標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出供試品溶液中葡萄糖的量，進(jìn)一步根據(jù)供試品制備過程計(jì)算得到艾納香供試品藥材中多糖的含量。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取1份艾納香藥材 (批次：20171003)，按照本文“2.3”的方法操作，連續(xù)測(cè)定吸光度6次，記錄吸光度A值分別為：0.4292、0.4287、0.4290、0.4101、0.4009、0.4296，RSD值為2.98% ，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密度試驗(yàn)用溶液，分別放置0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，記錄吸光度A值分別為：0.4292、0.4208、0.4103、0.4201、0.4109、0.4277、0.4265，RSD值為1.83%，表明樣品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份艾納香藥材 (批次：20171003)，按照“2.3”的方法平行操作，分別測(cè)定吸光度，記錄吸光度A值，并計(jì)算多糖的含量分別為：2.97%、3.15%、3.01%、3.10%、2.91%、3.02%，平均含量為3.03%，RSD值為2.87%，結(jié)果表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.5.4 回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量(3.03%)的艾納香藥材 (批次：20171003) 6份，每份約0.25g，分別精密加入約7.5 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL后，水浴蒸干，按照本文“2.3”的方法平行操作，分別測(cè)定吸光度，記錄吸光度A值，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法回收率較好，見表1。

表1 樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定 按“2.4”項(xiàng)下方法制備不同批次供試品溶液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其多糖的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 不同批次艾納香中的多糖含量

3 討論

多糖含量的測(cè)定方法主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)法等，其中苯酚-硫酸法及蒽酮-硫酸法的原理是將多糖水解并脫水后與苯酚或蒽酮反應(yīng)成有色化合物，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度；而DNS法的原理是3,5-二硝基水楊酸與還原糖反應(yīng)生成棕紅色的氨基化合物，因此可以直接測(cè)定還原糖，或者經(jīng)水解后測(cè)定總糖含量。劉剛等[15]通過蒽酮-硫酸法及3,5-二硝基水楊酸(DNS)法對(duì)艾納香中的糖類成分含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示艾納香中的總糖含量為：14.32%～43.28%，還原糖含量為：2.73%～7.75%，多糖含量為：9.61%～34.22%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本文采用苯酚-硫酸法測(cè)定的結(jié)果2.19%～3.11%。可能與藥材的產(chǎn)地、采收時(shí)間等影響因素有關(guān)，也可能是測(cè)定方法的原因。苯酚-硫酸法基本不受蛋白質(zhì)的影響，且產(chǎn)生的有色化合物較為穩(wěn)定；蒽酮-硫酸法幾乎可以測(cè)定所有碳水化合物，但色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有一定干擾，且穩(wěn)定性較差；DNS法中顯色劑易與色素等還原性物質(zhì)顯色，干擾測(cè)定結(jié)果，并且水解時(shí)間要求控制嚴(yán)格。紫外分光光度法測(cè)定藥材中某一類成分易受到其它成分的干擾，準(zhǔn)確性易受到影響。然而，對(duì)于多糖類成分由于缺少紫外吸收，無(wú)法采用高效液相法測(cè)定，因此，仍廣泛采用顯色法利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其含量。因此，在選擇多糖的含量測(cè)定方法時(shí)宜盡量對(duì)藥材中的化學(xué)成分類型全面研究，針對(duì)其化學(xué)成分組成選擇對(duì)多糖含量影響較小的測(cè)定方法。

目前多糖的提取工藝主要有熱水浸提法、加熱回流法、超聲提取法、微波提取法、酶提法等，本文參考《中國(guó)藥典》中藥材多糖含量的測(cè)定方法，并對(duì)加水量、回流時(shí)間、及顯色加熱時(shí)間等進(jìn)行了考察，并優(yōu)選出最佳的提取及顯色條件。

多糖類成分在自然界中分布廣泛，大部分多糖都具有多種生物活性。艾納香是貴州大力發(fā)展的道地苗藥，主要用于冰片的提取，已有文獻(xiàn)報(bào)道艾納香還含有黃酮類、倍半萜類等多種化學(xué)成分，但很少有對(duì)艾納香中多糖類成分的報(bào)道。本文以葡萄糖為對(duì)照品，建立了苯酚-硫酸法測(cè)定艾納香中多糖含量的測(cè)定方法，為艾納香藥材資源的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。