時麗潔 蔣樅璁 王方梅 楊 平,* 馮宗云

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥青稞研究中心,四川成都 611130；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)基因家族編碼一類含有硫氧還蛋白(thioredoxin,TRX)結(jié)構(gòu)域的PDI 蛋白和PDI 類蛋白(PDI-like)。這些蛋白大量存在于真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(ER)中,具有催化蛋白質(zhì)二硫鍵氧化還原反應(yīng)、協(xié)助蛋白質(zhì)分子異構(gòu)以及保障成熟的蛋白質(zhì)分子正確折疊等功能,行使類似分子伴侶的作用[1-4]。典型的PDI 蛋白由5 個基本結(jié)構(gòu)域(a,b,b',a',c)組成,其中具有氧化還原催化活性的兩處位點位于a 和a'結(jié)構(gòu)域的-CGHC-(-Cys-Gly-His-Cys-)序列中,而結(jié)構(gòu)域b和b'則是在異構(gòu)化反應(yīng)中起著結(jié)合底物、維持結(jié)構(gòu)的作用[5-7]；c 結(jié)構(gòu)域?qū)︹}離子(Ca2+)具有高親和性,且在其 C 末端富含酸性氨基酸序列(典型的如-KDEL-),為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號[8-9]。除了上述典型的結(jié)構(gòu)域,一些PDIL 蛋白中還含有額外結(jié)構(gòu)域,如D、COPII、J 和ARMET,可以根據(jù)它們對PDIL 蛋白進行更細致的分類[10-11]。

植物中的PDI 家族基因一般被命名為PDI 類蛋白基因(PDIL),前人對擬南芥、水稻和玉米的PDIL蛋白序列進行聚類分析,根據(jù)功能結(jié)構(gòu)域的組成類型及數(shù)目,認為在植物中至少存在8 個PDIL 蛋白亞家族(命名為PDIL1-PDIL8)[12]。大多數(shù)的PDIL 蛋白被定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),輔助蛋白質(zhì)合成過程中的正確折疊；但是,也有個別的PDIL 成員定位在細胞的其他位置,如線粒體、葉綠體、高爾基體、分泌囊泡或質(zhì)膜上,行使的功能也非常多樣化[10,13-15]。植物PDIL基因的生物學(xué)功能研究,多集中在種子發(fā)育與貯藏蛋白代謝方面。擬南芥的AtPDIL2-1基因可以影響胚珠的結(jié)構(gòu),并通過引導(dǎo)花粉管的生長來促進胚囊的發(fā)育[16]。AtPDIL1-1基因則作為分子伴侶,在內(nèi)種皮細胞發(fā)生程序性死亡過程之前抑制半胱氨酸蛋白酶向液泡的運輸[14]。水稻的OsPDIL1-1基因被證實是種子醇溶蛋白和谷蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確組裝和配送所必需的,該基因的缺失將導(dǎo)致水稻胚乳形成粉狀淀粉,同時誘發(fā)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(ER-stress)反應(yīng)[17-21]。在玉米胚乳中過量表達PDI基因,將導(dǎo)致貯藏蛋白結(jié)構(gòu)的改變,由此推測該基因調(diào)控著蛋白體的合成與交聯(lián)[22]。近年來,PDIL基因在植物應(yīng)對生物或非生物脅迫反應(yīng)中的作用越來越受到關(guān)注。擬南芥在受到化學(xué)試劑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫條件下,有6 個PDI基因的表達會顯著上升[23]。干旱、冷脅迫、鹽分脅迫和ABA 處理,會誘導(dǎo)玉米中的PDI基因表達量上升[24]。而小麥中也有一些PDI基因會在非生物脅迫條件下上調(diào)表達[25]。另外,陸續(xù)有研究報道小麥中的某些PDI基因還參與了植物對真菌病害的抗病反應(yīng)[26-27]。

大麥(Hordeum vulgare)是重要的禾谷類作物,具有耐寒、耐旱、耐貧瘠等優(yōu)異特性。大麥黃花葉病是歐洲與東亞國家大麥生產(chǎn)中一種流行的病害,由大麥黃花葉病毒(Barley yellow mosaic virus,BaYMV)或大麥溫性花葉病毒(Barley mild mosaic virus,BaMMV)感染引起,該病毒借助中間宿主禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)在土壤中傳播,從大麥根系入侵[28-29]。近年來克隆的一個大麥黃花葉病廣譜抗性基因HvPDIL5-1就是PDIL基因家族的成員,并且已被證實HvPDIL5-1基因可以作為感病因子(即基因功能丟失后,導(dǎo)致隱性抗病性),參與BaYMV/ BaMMV 對大麥的感染過程[30]。

目前,在禾本科物種水稻[12]、玉米[12]、小麥[31]以及二穗短柄草[32]中均有針對PDIL基因家族的系統(tǒng)的鑒定與分析,但在大麥中還沒有類似的報道。本研究利用開放的數(shù)據(jù)庫資源,鑒定出了大麥的PDIL基因,對它們進行了序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生、以及時空表達模式的分析,并且通過定量PCR 實驗檢測了這些基因在大麥接種病毒前后的表達差異。

1 材料與方法

1.1 HvPDIL 基因家族成員的生物信息學(xué)分析

1.1.1 不同物種中PDIL基因的序列來源 擬南芥(Arabidopsis thaliana)的13 個PDILs基因、水稻(Oryza sativa)的12 個PDILs基因、小麥(Triticum aestivum)的9 個PDILs基因和玉米(Zea mays)的12個PDILs基因的核苷酸序列與氨基酸序列(FASTA文件)均下載于NCBI 數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.1.2HvPDIL基因家族成員的鑒定 通過已知的水稻12 個PDILs基因序列,在NCBI 和大麥數(shù)據(jù)庫BARLEX(https：//apex.ipk-gatersleben.de/apex/f?p=284)中對大麥全基因組序列進行BLAST 檢索,獲得大麥的PDILs基因序列及其在數(shù)據(jù)庫中的編號(Accessions)。利用NCBI 中檢索出的HvPDILs基因序列在 BARLEX(https：//apex.ipk-gatersleben.de/ apex/f?p=284)數(shù)據(jù)庫中再次檢索,獲得各個HvPDILs基因的位點編號(ID)及染色體物理位置,同時使用MapChart 軟件繪制HvPDILs基因的染色體分布圖。

1.1.3 大麥PDILs 蛋白的結(jié)構(gòu)分析 利用在線軟件ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸編碼序列長度及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)(分子量、等電點),采用SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)預(yù)測大麥PDIL 蛋白的信號肽。利用NCBI保守結(jié)構(gòu)分析(Conserved Domains)在線工具(https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析大麥PDIL 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.1.4HvPDIL基因家族的系統(tǒng)進化分析、組織和時空表達分析 利用MEGA7.0 軟件對大麥、小麥、水稻、玉米和擬南芥的PDILs 氨基酸序列進行多序列比對(ClustalW),將多序列比對結(jié)果采用Neighbor-Joining 方法進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建,重復(fù)1000 次。HvPDILs基因的組織和時空表達數(shù)據(jù)來源于 BARLEX 數(shù)據(jù)庫(https：//apex.ipk-gatersleben.de/ apex/f?p=284),將HvPDILs基因的表達豐度FPKM值統(tǒng)一取對數(shù)log2FPKM 標準化,使用GraphPad Prism 7 軟件進行數(shù)據(jù)展示。

1.2 HvPDILs 基因在大麥黃花葉病毒侵染條件下的表達差異分析

1.2.1 大麥材料的種植與接種 將大麥黃花葉病易感品種“Igri”種植在正常溫室條件下(白天20°C,14 h；夜晚18°C,10 h),兩周苗齡幼苗通過葉片摩擦接種大麥溫性花葉病毒(BaMMV-ASL),接種方法如前人所述[33]；以不含病毒的ddH2O 作為摩擦接種的陰性對照(Mock)。將接種后的植株移到低溫培養(yǎng)箱中(白天12°C,14 h；夜晚8°C,10 h)培育。

1.2.2 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄和BaMMV 病毒檢測

在接種后5 周,取接種病毒與接種ddH2O 的大麥幼苗新生葉,各取6 個單株作為生物學(xué)重復(fù)。利用TRIzol 試劑(Invitrogen,USA)提取總RNA。利用RT Kit with gDNA Eraser 試劑(北京金百特生物技術(shù)有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。將cDNA 按1∶10 稀釋后作為PCR 模板,采用BaMMV 特異性引物檢測植株感染情況(表3)。

1.2.3 熒光定量 PCR 檢測基因表達 采用BatchPrimer 3 設(shè)計HvPDILs基因的qPCR 引物(表3),并進行qPCR 檢測引物的擴增效率。qPCR 反應(yīng)體系為15 μL,包含2 μL cDNA,1.5 μL primer-F/R(5 μmol L-1),7.5 μL SYBR-mix,2.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95°C 預(yù)變性2min；95°C 15 s,61°C 20 s,45 個循環(huán)；溶解曲線程序為65～95°C,每個循環(huán)+0.5°C、維持5 s。以HvUBIQUITIN為內(nèi)參基因[30],檢測各個HvPDIL基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HvPDIL 基因家族成員的鑒定與結(jié)構(gòu)分析

利用水稻中已鑒定的12 個PDILs基因序列為參考,在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸序列檢索,其中OsPDIL1-2與OsPDIL1-3檢索到大麥的同一個基因(AK368066.1),另外在 NCBI 數(shù)據(jù)庫以及大麥BARLEX 數(shù)據(jù)庫中都無法檢索到與OsPDIL2-2同源的大麥基因,所以最終確認了10 個HvPDILs基因(表1)。與之對應(yīng),在大麥BARLEX 數(shù)據(jù)庫中找到10 個HvPDILs基因相應(yīng)的基因編號與物理定位,它們分布在除了3H染色體之外的其他6 條染色體上(圖1)。其中,9 個HvPDILs基因編碼序列長度均在1500 bp 左右,而HvPDIL5-1基因的編碼序列僅456 bp。

表1 大麥PDI 基因家族信息 Table1 Identified PDI genes in barley genome

圖1 HvPDILs 基因的染色體分布 Fig.1 Chromosomal location of HvPDILs

根據(jù)功能結(jié)構(gòu)域的組成和數(shù)目,PDIL 被分成PDIL1、PDIL2 和PDIL5 三個亞家族[12]。通過分析10 個大麥PDIL 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和功能元件(圖2和表2),發(fā)現(xiàn)其中PDIL1 類的4 個蛋白都具有PDIL蛋白典型的-a-b-b'-a'-型結(jié)構(gòu)域；PDIL2 類的2 個蛋白具有-a-a'-型結(jié)構(gòu)域,其中HvPDIL2-2 蛋白還含有一個P5_c 結(jié)構(gòu)域,它類似b 結(jié)構(gòu)域,在催化時具有底物結(jié)合功能；PDIL5 類的4 個蛋白具有-a-型結(jié)構(gòu)域。具有氧化還原催化活性的a 或a'結(jié)構(gòu)域中通常含有保守氨基酸序列“C-X-X-C”,除了HvPDIL5-4蛋白(“C-X-X-S”)之外,其他HvPDILs 蛋白均含有該保守氨基酸序列(表2)。PDIL 蛋白 C 末端的“K-D-E-L”序列為典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號,HvPDIL1-1、HvPDIL1-3 和HvPDIL1-4 蛋白具有該特征序列,部分家族成員含有“R-D-E-L”(如HvPDIL1-2 蛋白)、“E-D-E-L”(如HvPDIL5-1 蛋白)或者“K-E-E-L”(如HvPDIL2-2 蛋白)等定位信號,暗示這些基因的編碼蛋白也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外,HvPDIL2-1 和HvPDIL5-4 蛋白分別含有特殊結(jié)構(gòu)域ERp29 和COPIIcoated_ERV(Endoplasmic reticulum vesicle transporter,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡轉(zhuǎn)運體),兩者是常見于哺乳動物細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白,其具體的生物學(xué)功能尚不清楚。

圖2 大麥PDILs 蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖 Fig.2 Graphic representation of barley PDIL-likes proteins

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2.2 HvPDIL 基因家族的系統(tǒng)進化分析

依據(jù)編碼氨基酸序列的相似性,構(gòu)建了5 個物種PDILs 的系統(tǒng)進化樹(圖3)。這5 個物種的PDILs蛋白聚類成8 個系統(tǒng)發(fā)育分支,大麥的10 個PDILs分布于這8 個分支中,暗示在植物中這些PDILs 可能是直系同源蛋白,推測其生物學(xué)功能也是保守的。相對于水稻OsPDILs 和玉米ZmPDILs,大麥HvPDILs 與小麥TaPDILs 的系統(tǒng)進化關(guān)系最近(如HvPDIL1-1 和 TaPDIL1-1),呈現(xiàn)一一對應(yīng)的關(guān)系,暗示大麥與小麥的PDILs 的生物學(xué)功能可能具有相似性。

2.3 HvPDILs 基因的組織與時空表達分析

從大麥BARLEX 數(shù)據(jù)庫下載了10 個HvPDILs基因的表達豐度數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)包含胚胎、幼根、苗期地上部分、新生穗、第3 節(jié)間分蘗、前期灌漿籽粒、后期灌漿籽粒、黃化苗、主穗、漿片、內(nèi)稃、外穎殼、穗軸、灌漿期根部、衰老葉共15 個時期及組織的表達情況。圖4顯示,在不同時期和不同組織中10 個HvPDILs基因均有所表達,推測這些基因均具有生物學(xué)功能。其中,HvPDIL1-1(在15 個時期及組織中的表達豐度范圍為57.25～8524.67,平均值為973.67)和HvPDIL2-1(在15 個時期及組織中的表達豐度范圍為81.66～508.02,平均值為237.06)均呈現(xiàn)總體很高的基因表達水平,HvPDIL1-2(在15 個時期及組織中的表達豐度范圍為0.07～6.94,平均值為 1.41)和HvPDIL1-3(在15 個時期及組織中的表達豐度范圍為0.12～1.33,平均值為0.59)總體表達量很低,其他6 個基因表達豐度較高,在不同的組織中略有差異。值得注意的是,HvPDIL1-1在籽粒發(fā)育時期的表達豐度最高,暗示其在大麥籽粒的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

圖3 大麥與小麥、水稻、玉米、擬南芥PDILs 同源蛋白的系統(tǒng)進化樹 Fig.3 Phylogenetic tree of PDIL homologous proteins from barley,wheat,rice,maize,and Arabidopsis

圖4 HvPDILs 基因的組織表達情況 Fig.4 Transcriptional abundance of HvPDILs in different tissues

2.4 BaMMV 接種后HvPDILs 基因的表達分析

我們先前的研究結(jié)果證實,HvPDIL5-1作為感病因子參與BaYMV/BaMMV 病毒感染過程,該基因功能丟失可導(dǎo)致對大麥黃花葉病的廣譜抗病性[30]。為了探究這些HvPDILs在大麥黃花葉病感染過程中的作用,我們分析了BaMMV 接種后HvPDILs基因表達水平的變化。首先,以HvUBIQUITIN為內(nèi)參基因[30],采用BaMMV 的特異性引物進行擴增(表3),qPCR 證實接種后的葉片中含有BaMMV。隨后,采用本研究設(shè)計的10 對HvPDILs基因特異性引物(表3),分析在感病葉片和對照葉片中10 個HvPDILs基因的相對表達水平。如圖5所示,對照葉片中HvPDIL1-1、HvPDIL1-3和HvPDIL1-4這3 個基因的表達水平較高,但是病毒感染后這些基因表達水平顯著降低。HvPDIL5-1的表達水平很低,病毒接種后其表達水平也顯著降低。HvPDIL5-4在感病葉片中的表達水平顯著高于對照,說明病毒感染會誘導(dǎo)該基因表達。這些在病毒接種后出現(xiàn)顯著表達差異的HvPDILs基因,很可能與BaMMV 感染過程相關(guān)。而HvPDIL1-2、HvPDIL2-1、HvPDIL2-2、HvPDIL5-2及HvPDIL5-3這5 個基因的表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著性變化。

表3 qPCR 引物及擴增片段 Table3 Primers used for qPCR and length of amplified fragments

(續(xù)表3)

圖5 病毒接種后葉片中HvPDILs 基因的相對表達分析 Fig.5 Relative expression level of HvPDILs in leaves of virus-infected plants

3 討論

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶在真核生物中行使著重要功能,其生化功能包括催化二硫鍵的形成與斷裂,輔助蛋白質(zhì)正確折疊；其生物學(xué)功能包括參與生長發(fā)育、生物或非生物脅迫應(yīng)答等。本研究從大麥中鑒定出10 個HvPDILs基因,生物信息學(xué)分析顯示其具有該蛋白家族成員典型的序列結(jié)構(gòu)和亞細胞定位信號,分屬于PDIL1、PDIL2 和PDIL5 三個亞家族,其中PDIL1 亞家族成員同時具有氧化還原催化活性位點(a 或a')和底物結(jié)合位點(b 或b'),而PDIL5 亞家族成員不具有底物結(jié)合位點。由此推測,PDIL5 亞家族中的成員在行使催化功能時,需要與其他因子作用形成功能復(fù)合體,才能錨定底物。近年有研究者發(fā)現(xiàn),來源于簇毛麥的一個PDI-V基因在感染小麥白粉病菌后出現(xiàn)顯著的差異表達,其編碼蛋白可以與E3 泛素連接酶CMPG1 互作,從而參與小麥白粉病的抗病反應(yīng)[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)HvPDIL1-1在各組織中的表達水平很高,尤其是在籽粒發(fā)育時期,與之前報道的HvPDIL1-1在籽粒發(fā)育后期的胚乳中表達最為豐富一致,由此推測HvPDIL1-1在淀粉顆粒和貯藏蛋白的形成過程中發(fā)揮重要作用[34]。PDIL1-1 作為PDILs最典型的家族成員,其直系同源蛋白具有較高的氧化還原活性[35]。在水稻中OsPDIL1-1基因被證實參與種子醇溶蛋白和谷蛋白的組裝和配送以及淀粉狀胚乳的發(fā)育[17-21]。而本研究發(fā)現(xiàn),BaMMV 接種后葉片中HvPDIL1-1基因的表達相較于對照顯著降低,由此我們猜測該基因在不同組織中發(fā)揮著不同功能,在籽粒中調(diào)控胚乳的發(fā)育,而在葉片中則響應(yīng)病毒侵染、參與抗病或感病過程。大麥黃花葉病是由雙鏈病毒感染的土傳病害,該病毒顆粒只編碼10 個成熟蛋白,因而其生命周期的完成需要借助寄主感病因子參與。前期我們已經(jīng)證實,HvPDIL5-1作為病毒必須的感病因子,參與了病毒的感染過程[30]。本研究發(fā)現(xiàn),BaMMV 病毒感染后多個HvPDILs基因的表達水平顯著上調(diào)或下調(diào),說明這些HvPDILs參與抗或感大麥黃花葉病的過程。值得注意的是,對比本研究與前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[12,31-32],植物PDILs 家族基因的編碼序列通常位于1000 bp 到2000 bp 之間,而PDIL5-1基因編碼序列通常小于500 bp,顯示其是一個非常特殊的家族成員。相對該基因家族的其他成員,PDIL5-1基因發(fā)生了較大的結(jié)構(gòu)分化,推測該基因可能源自于物種進化早期其他家族基因的部分復(fù)制。大麥HvPDIL5-1在各個組織、發(fā)育時期中整體表達水平較低(圖4),病毒侵染后該基因進一步下調(diào)表達(圖5)。盡管植物中PDIL5-1基因在系統(tǒng)進化中是高度保守的,HvPDIL5-1基因功能缺失的突變體具有對大麥溫性花葉病毒的抗性,但是在植株生長發(fā)育等其他方面沒有異常[30]。因此,推測該基因與其他家族成員存在功能冗余,為其選擇性丟失從而導(dǎo)致病毒抗性提供了可能。

4 結(jié)論

在大麥中共鑒定出10 個HvPDILs基因,分別定位在大麥的6 條染色體上,根據(jù)功能結(jié)構(gòu)域的組成形式可分為PDIL1、PDIL2、PDIL5 三個亞家族；其中5 個HvPDILs基因在大麥接種BaMMV 后出現(xiàn)顯著的表達上調(diào)或下調(diào),說明這些基因可能參與大麥黃花葉病感染過程,但是各個HvPDILs基因或獨立作用或結(jié)合互相拮抗/協(xié)同作用都有待后續(xù)繼續(xù)研究。