張雙雙 王立偉 姚 楠 郭光艷 夏玉鳳 秘彩莉

河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北石家莊 050024

在真核生物中,自噬是在液泡(植物和酵母)或溶酶體(動(dòng)物)中將胞內(nèi)組分降解的細(xì)胞學(xué)過程。參與自噬途徑的基因稱為自噬相關(guān)基因(aut ophagy- associated g enes,ATG)[1]。在營養(yǎng)缺乏時(shí),生物通過非選擇性自噬途徑將胞內(nèi)組分(包括蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)大規(guī)模降解,以實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的回收和再利用[2]。此外,通過自噬途徑還可以將受損的細(xì)胞器和有毒的大分子選擇性地清除,即選擇性自噬。選擇性自噬由自噬受體介導(dǎo),自噬受體不僅能識(shí)別自噬底物,還能與自噬體的標(biāo)記蛋白 ATG8(在哺乳動(dòng)物中也稱LC3,microtubule-associated protein 1 l ight chain 3)相互作用,從而將自噬底物運(yùn)送至自噬體進(jìn)行降解[3]。

p62(也稱Sequestosome-1,SQSTM1)和NBR1(Next toBRCA1 gene1,NBR1)是哺乳動(dòng)物中最主要的選擇性自噬受體[4-5],兩者的結(jié)構(gòu)域組成和排列順序相似——N端的PB1(Phox andBem1p,PB1)結(jié)構(gòu)域,中間的鋅指結(jié)構(gòu)域ZZ,C端的UBA(Ubiquitin associated,UBA)結(jié)構(gòu)域。UBA結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了p62和NBR1與單泛素和/或多聚泛素鏈間的結(jié)合,PB1結(jié)構(gòu)域則介導(dǎo)其自身的多聚化及與其他有PB1結(jié)構(gòu)域的蛋白間的相互作用[5-7]。

雖然p62在人類中的研究已經(jīng)非常廣泛而深入,但其在植物中同源蛋白的研究卻屈指可數(shù),迄今只在擬南芥、煙草和馬鈴薯中有過相關(guān)報(bào)道。與p62相比,擬南芥中的NBR1無論在結(jié)構(gòu)域組成還是氨基酸序列上都與哺乳動(dòng)物中的NBR1 更相似。AtNBR1有2個(gè)UBA 結(jié)構(gòu)域,但只有C末端的UBA結(jié)構(gòu)域能夠與泛素結(jié)合[8]。AtNBR1在熱、氧化、鹽和干旱等非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,而且這些生物學(xué)功能依賴于NBR1與ATG8的相互作用[9]。Ntjoka2是煙草中的NBR1蛋白。Ntjoka2能夠與ATG8f 結(jié)合；過量表達(dá)Ntjoka2的煙草植株對(duì)營養(yǎng)缺乏的反應(yīng)減弱[10]。Ntjoka2可以以單體或寡聚體的形式存在；Ntjoka2通過PB1-PB1間的相互作用參與自噬體的形成[11]。此外,Joka2類蛋白(即NBR1蛋白)也參與植物的防御反應(yīng)。PexRD54是來源于愛爾蘭馬鈴薯致病疫霉的效應(yīng)蛋白,PexRD54 與寄主ATG8CL間的結(jié)合刺激了自噬體的形成。PexRD54可以將Joka2從ATG8CL復(fù)合體中解離出來從而干擾Joka2在植物病原防御反應(yīng)中的積極作用[12]。綜上所述,已報(bào)道的植物中的NBR1類蛋白參與了生物/非生物脅迫反應(yīng)以及對(duì)營養(yǎng)缺乏的響應(yīng),但尚未有此類蛋白參與植物發(fā)育過程的相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期從小麥中克隆了一個(gè)含有UBA結(jié)構(gòu)域的基因,將其命名為TaUBA。分析表明,TaUBA的結(jié)構(gòu)域組成和排列方式與人類的p62及NBR1類蛋白非常相似。研究表明,過量表達(dá)TaUBA的擬南芥株系耐鹽性下降；去掉UBA結(jié)構(gòu)域或ZZ結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變可解除TaUBA對(duì)鹽脅迫反應(yīng)的抑制效應(yīng)[13]。由于小麥的轉(zhuǎn)化效率較低,在小麥中研究基因的功能比較困難。為了深入研究NBR1類蛋白在植物中的功能,本實(shí)驗(yàn)室通過Blast找到了TaUBA在水稻中的同源蛋白并將其命名為OsUBA(XP_015625351)。結(jié)構(gòu)域分析表明,OsUBA與TaUBA、AtNBR1以及Ntjoka2的結(jié)構(gòu)域組成一致,是水稻中的NBR1類蛋白,即水稻中的自噬受體。

本研究擬對(duì)水稻中的NBR1類蛋白OsUBA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過對(duì)OsUBA p：Gus水稻株系的Gus染色研究OsUBA的表達(dá)特性,通過在水稻中過量表達(dá)OsUBA研究OsUBA的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料及處理 水稻(Oryza sativaL.)日本晴種子由本院朱正歌教授惠贈(zèng)。水稻日本晴和各轉(zhuǎn)基因水稻株系均種植于河北師范大學(xué)(河北省石家莊市)院內(nèi)的水稻池中。用于開花期統(tǒng)計(jì)的OsUBA過表達(dá)水稻株系及野生型分別于2017年6月3日種植、11月10日收獲；2018年5月17日種植、11月8日收獲。在種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)中用到的水稻材料種植于2017年5月18日、收獲于11月10日。

1.1.2 主要試劑和菌株 RNA 提取試劑RNAiso Plus、cDNA 第1 鏈合成試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶均購自Takara(大連)公司；pGEM-T 載體購自Promega 生物技術(shù)有限公司,TransTaq HiFi DNA Polymerase 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α感和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105 為實(shí)驗(yàn)室自行制備,SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒、普通Taq酶及其他生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻OsUBA基因的克隆與序列分析 基于OsUBA的mRNA 序列(XM_015769865),應(yīng)用Primer 5 設(shè)計(jì)引物OsUBA-F1(5′-ATGTCCGGCCGG AGCTCG-3′)和OsUBA-R1(5′-TCACTGGTCTTTCT TCTCCCT-3′)用于OsUBA的擴(kuò)增。提取正常培養(yǎng)5 d的水稻日本晴根的總 RNA,然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA 第1 鏈作為模板擴(kuò)增OsUBA的開放閱讀框ORF。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸2 min,30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及膠回收純化后,與pGEM-T 載體16℃連接過夜(約10 h),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α桿感受態(tài)細(xì)胞,將PCR 鑒定呈陽性的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序正確的陽性克隆命名為T-OsUBA。

利用在線分析軟件 SignalP 4.1 Server(http：// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和NetPhos 2.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分別分析OsUBA基因編碼蛋白的信號(hào)肽序列、跨膜結(jié)構(gòu)域以及磷酸化位點(diǎn)數(shù)目；利用Psort(http：//www.psort.org/)軟件預(yù)測(cè)OsUBA 蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.2 水稻OsUBA基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆與序列分析 根據(jù)水稻參考基因組(Oryza sativa japonicaGroup cultivar Nipponbare chromosome 2,IRGSP- 1.0)Os02g0593700 上游的基因組序列信息(22,981,857～22,989,595)設(shè)計(jì)引物OsUBAp-F1(5'-AAGCTTCACAAAGTACAATGGGAACAAA-3',Hind III)和OsUBAp-R1(5'-GTCGACCGCGGGGGTGCGG GC-3',SalI),以正常培養(yǎng)2 周的日本晴幼苗葉片的 DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸4 min,35 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、連接pGEM-T 載體和轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 后測(cè)序驗(yàn)證,將驗(yàn)證正確的克隆命名為T-OsUBAp1,并利用PlantCARE[14]在線分析軟件分析OsUBA啟動(dòng)子的序列特征。

1.2.3OsUBA p：Gus 載體和OsUBA基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建 以含T-OsUBAp1的菌液為模板,以O(shè)sUBAp-F2(5'-AAGCTTCACAAAGTACAATGGGA ACAAA-3',HindIII)和OsUBAp-R2(5'-GTCGAC CG CGGGGGTGCGGGC-3',SalI)擴(kuò)增帶有HindIII/SalI酶切位點(diǎn)的OsUBA啟動(dòng)子片段,將PCR 產(chǎn)物膠回收后連接pGEM-T 載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的克隆命名為T-OsUBAp2。提取pCAMBIA1391Z 和T-OsUBAp2的質(zhì)粒,分別用HindIII/SalI進(jìn)行雙酶切,電泳回收目的條帶,連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,陽性克隆經(jīng)菌液PCR 和HindIII/SalI 雙酶切進(jìn)行鑒定,鑒定正確的克隆即為構(gòu)建成功的OsUBA p：Gus載體。

以含 T-OsUBA的菌液為模板,以O(shè)sUBA-F2(5'-TCTAGAATGTCCGGCCGGAGCT-3',XbaI)和OsUBA-R2(5'-GGTACCTCACTGGTCTTTCTTCTC- 3',KpnI)擴(kuò)增帶有XbaI 和KpnI 酶切位點(diǎn)的OsUBA基因的 CDS 片段,將 PCR 產(chǎn)物膠回收后連接pGEM-T 載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,陽性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后命名為T-OsUBA-OX。提取pCAMBIA1300 和T-OsUBA-OX 的質(zhì)粒,XbaI/KpnI 雙酶切(37 ,3℃ h)后電泳并回收目的條帶,16℃連接過夜(約10 h),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,陽性克隆經(jīng)菌液PCR 和XbaI/KpnI 雙酶切鑒定,鑒定正確的克隆命名為35S：OsUBA,即構(gòu)建成功的OsUBA過表達(dá)載體。

1.2.4OsUBA p:Gus和35S：OsUBA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻 提取OsUBA p:Gus和35S：OsUBA的質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 感受態(tài)細(xì)胞,然后將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素(50 μg mL-1)和利福平(50 μg mL-1)的YEP 固體培養(yǎng)基上,經(jīng)28℃培養(yǎng)72 h,挑取單克隆分別進(jìn)行PCR 檢測(cè)及質(zhì)?；剞D(zhuǎn)大腸桿菌后的雙酶切鑒定。鑒定正確的農(nóng)桿菌克隆可用于轉(zhuǎn)化水稻。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[15]將含有OsUBA p：Gus和35S：OsUBA質(zhì)粒的EHA105 重組菌株分別轉(zhuǎn)化水稻日本晴,轉(zhuǎn)化得到T0代轉(zhuǎn)基因水稻株系。將收獲的T0轉(zhuǎn)基因水稻種子經(jīng)過連續(xù)2 代潮霉素(50 μg mL-1)篩選直至獲得T2代轉(zhuǎn)基因水稻純合株系。

1.2.5OsUBA p：Gus和35S：OsUBA水稻株系RNA水平的鑒定 對(duì)按上述方法篩選到的T2代轉(zhuǎn)基因水稻純合株系進(jìn)行RNA 水平檢測(cè)。

采用 TRIzol 法提取正常培養(yǎng)10 d 的T2代OsUBA p：Gus水稻株系根的總 RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用RT-PCR 檢測(cè)Gus(所用引物為GusF：5'-GGGCAGGCCAGCGTATCG-3'和GusR：5'-CGGC GAAATTCCATACCTG-3')基因的表達(dá)水平,以水稻Actin基因(GenBank 登錄號(hào)為AK100267.1)為內(nèi)對(duì)照(引物序列為ActinF：5'-CTTCAACACCCCTGCT ATG-3'和ActinR：5'-TCCATCAGGAAGCTCGTAG-3')。

采用 TRIzol 法提取正常培養(yǎng)10 d 的T2代35S：OsUBA水稻株系葉片的總 RNA,按 照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,中國大連)說明書合成cDNA 第1 鏈,稀釋10 倍后作為qRT-PCR 的模板。在 Primer Premier 5.0 軟件中設(shè)計(jì)檢測(cè)OsUBA基因的qRT-PCR 引物(引物序列為OsUBAqF：5'-CGTCGTCCTCAAGGTGAAGTA-3'和OsUBAqR：5'-CATCCAGCATGACAATATCCC-3'),以水稻Actin基因(GenBank 登錄號(hào)為AK100267.1)為內(nèi)參(引物序列為：Actin-qF：5'-CGGGAAATTGT GAGGGACAT-3'和Actin-qR：5'-AGGAAGGCTGGA AGAGGACC-3')。采用 ABI 7300 Real-time PCR System(美國)進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè),并按照TB Green Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)(Takara,中國大連)說明書配置反應(yīng)體系。qRT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt[16]計(jì)算OsUBA基因的相對(duì)表達(dá)量,利用Graphpad Prism7 軟件繪制柱狀圖。

1.2.6 利用OsUBA p:Gus轉(zhuǎn)基因水稻株系研究OsUBA的表達(dá)特性 將OsUBA p:Gus水稻植株的花、開花期主莖的莖節(jié)和第2 節(jié)間的切片、萌發(fā)1 d及3 d 的種子、生長7 d 的幼苗分別移入加有1 mL Gus 染液(Gus 染色液配方：100 mmol L-1磷酸緩沖液pH 7.0,0.5% Triton X-100,20%甲醇和0.5 mg mL-1X-Gluc)的離心管中,37℃染色,待染出理想效果后,吸去反應(yīng)液,用無水乙醇脫色1～6 h,吸去乙醇,體式顯微鏡下拍照記錄。

用200 μmol L-1ABA 和100 μmol L-1GA分別處理萌發(fā)2 d 的種子根24 h,然后Gus 染色25 min,通過對(duì)比Gus 染色情況研究ABA 和GA 處理對(duì)OsUBA表達(dá)的影響。

1.2.7OsUBA過表達(dá)水稻株系開花時(shí)間和種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)室于2017年和2018年連續(xù)2個(gè)年度分別對(duì)野生型水稻日本晴及 3 個(gè)過表達(dá)OsUBA水稻株系(L10、L14 和L15)的開花時(shí)間進(jìn)行了田間調(diào)查。每個(gè)植株的第1 個(gè)穗子開花即記錄為開花植株；以所有株系中最早開花的植株出現(xiàn)的那一天定為第1 天,以后每天統(tǒng)計(jì)一次各株系中開花的株數(shù),直至所有植株開花結(jié)束為止。2 個(gè)年度統(tǒng)計(jì)的各水稻株系及野生型均為30 株。

為了研究ABA 及GA 處理對(duì)OsUBA過表達(dá)水稻 株系(L10、L14 和L15)及野生型種子萌發(fā)的影響,將水稻日本晴及3 個(gè)OsUBA過表達(dá)水稻株系的種子(各100粒)經(jīng)消毒后分別點(diǎn)播于1/2 MS 培養(yǎng)基、含3 μmol L-1ABA 或100 μmol L-1GA 的1/2 MS 培養(yǎng)基上,在光照培養(yǎng)箱(28 ,16 h℃ 光照/8 h 黑暗)中萌發(fā),每12 h統(tǒng)計(jì)一次萌發(fā)情況,直至所有種子萌發(fā)為止。繪制各株系的種子萌發(fā)曲線圖,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsUBA 基因的克隆與序列分析

水稻OsUBA基因的CDS 全長為2538 bp,編碼845 個(gè)氨基酸殘基(圖1)。其編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為93.754 kD,理論等電點(diǎn)為5.31,其中脯氨酸和亮氨酸含量最高,分別為10.18%和8.64%；此外,有 107 個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp 和Glu)和79 個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg 和Lys),總體帶負(fù)電荷,屬親水蛋白。生物信息學(xué)分析表明,OsUBA 沒有信號(hào)肽序列及跨膜結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)有3 個(gè)磷酸化位點(diǎn)(絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸各一個(gè))。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,OsUBA 蛋白位于細(xì)胞核中的概率最大,為64.3%。

在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示,該蛋白具有多個(gè)介導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域：位于氨基端的PB1 結(jié)構(gòu)域(21～107 aa)、中間的ZZ 型鋅指結(jié)構(gòu)域(430～461 aa)和NBR1 結(jié)構(gòu)域(500～613 aa)以及羧基端的2 個(gè)UBA 結(jié)構(gòu)域(769～796 aa 和800～838 aa)(圖2),預(yù)示其可與多種蛋白質(zhì)相互作用,生物學(xué)功能復(fù)雜。

圖1 水稻OsUBA 基因的PCR 擴(kuò)增 Fig.1 PCR amplification of OsUBA gene in rice

圖2 水稻OsUBA 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) Fig.2 Conserved domain prediction of OsUBA protein

將OsUBA 的氨基酸序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫,利用 Blast 搜索其在水稻(Oryza sativaL.)、小麥(Triticum aestivumL.)、玉米(Zea maysL.)、谷子(Setaria italicaL.)、短柄草(Brachypodium distachyonL.)、高粱(Sorghum bicolorL.)、擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)及煙草(Nicotiana tabacumL.)等植物中的同源蛋白,并利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。系統(tǒng)分析表明,所有蛋白聚為兩個(gè)大的分支,其中,玉米、高粱、谷子、水稻、小麥、短柄草等單子葉植物的NBR1 類蛋白聚為一個(gè)分支；擬南芥和煙草等雙子葉植物的NBR1 蛋白聚成另一分支。OsUBA 即為水稻中的NBR1 X1 亞型,與水稻中的NBR1 X2 亞型相似性最高,氨基酸水平的一致性高達(dá)96.37%。上述結(jié)果說明,OsUBA 編碼水稻中的NBR1 類蛋白。

2.2 OsUBA 基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆與分析

以水稻日本晴基因組DNA 為模板擴(kuò)增OsUBA啟動(dòng)子區(qū)域,擴(kuò)增片段長1810 bp(圖4),將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆、測(cè)序,并與數(shù)據(jù)庫中的序列比對(duì),確認(rèn)該序列為OsUBA的啟動(dòng)子序列。

在PlantCARE 網(wǎng)站的分析顯示,在該啟動(dòng)子區(qū)域除含有啟動(dòng)子基本元件TATA-box 和CAAT-box 外,還有光響應(yīng)元件G-box 和Sp1,與激素相關(guān)的順式作用元件有ABRE、CGTCA-motif、TATC-box、P- box、GARE-motif 和TCA-element,與逆境響應(yīng)相關(guān)的GC-motif 和LTR,及其他組織特異性啟動(dòng)子元件等(表1)。

圖3 OsUBA 蛋白及其他植物中的同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析 Fig.3 Phylogenetic tree of OsUBA and its homologues in plants

圖4 OsUBA 基因啟動(dòng)子的PCR 擴(kuò)增 Fig.4 PCR amplification of OsUBA promoter

表1 OsUBA 基因啟動(dòng)子調(diào)控元件預(yù)測(cè) Table1 Prediction of cis-elements of OsUBA promoter by PlantCARE software

(續(xù)表1)

2.3 OsUBA p:Gus 載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

為了系統(tǒng)研究OsUBA基因的表達(dá)特性,構(gòu)建了OsUBA p:Gus載體。按前述方法將OsUBA啟動(dòng)子連接至pCAMBIA1391 載體的HindIII 和SalI 酶切位點(diǎn)之間,陽性克隆經(jīng)HindIII/SalI 酶切電泳后出現(xiàn)一條1810 bp 的條帶(圖5),說明OsUBA p:Gus載體構(gòu)建成功。

將OsUBA p:Gus載體轉(zhuǎn)化水稻日本晴,通過連續(xù)的潮霉素篩選獲得2 個(gè)轉(zhuǎn)基因純合株系L6 和L12。提取正常培養(yǎng)10 d 的OsUBA p:Gus水稻株系的根的總RNA,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中Gus 的表達(dá)。檢測(cè)表明這2 個(gè)株系中Gus均能正常表達(dá)(圖6),可用于后期對(duì)OsUBA表達(dá)的分析。

2.4 OsUBA 基因的表達(dá)特性分析

圖5 OsUBA p:Gus 載體的酶切鑒定 Fig.5 Identification of OsUBA p:Gus vector by double digestion

按前述方法對(duì)OsUBA p:Gus水稻株系L6 的各器官及正在萌發(fā)的種子進(jìn)行Gus 染色表明,OsUBA在水稻的根(包括種子根、冠根和側(cè)根)和幼葉(圖7-A)、莖(包括莖節(jié)和莖的節(jié)間,圖7-B,C)、花(主要是花藥,圖7-D)中的表達(dá)均較強(qiáng)；在萌發(fā)1 d 種子的胚(圖7-E)以及萌發(fā)3 d 種子的胚芽鞘和胚根中的表達(dá)量也很高,暗示其是一個(gè)遍在表達(dá)的基因,有可能參與植物生長發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過程。

圖6 OsUBA p:Gus 水稻株系中Gus 的表達(dá)分析 Fig.6 Analysis of Gus expression in OsUBA p:Gus transgenic rice plants

圖7 OsUBA 在不同器官和組織中的表達(dá)特性 Fig.7 Expression of OsUBA in different organs and tissues

利用200 μmol L-1ABA 和100 μmol L-1GA 分別處理萌發(fā)2 d 的OsUBA p:Gus水稻株系24 h,利用Gus 染色研究了ABA 和GA 對(duì)OsUBA表達(dá)的影響。與處理前相比(圖8-A),ABA 處理顯著抑制了OsUBA的表達(dá)(圖8-B)；GA 處理后,OsUBA的表達(dá)略有升高,但不顯著(圖8-C)。

2.5 OsUBA 基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)水平鑒定

按前述方法將OsUBA基因的 CDS 連接至pCAMBIA1300 載體,所得陽性克隆經(jīng)菌液 PCR(圖9-A)和XbaI/KpnI 雙酶切(圖9-B)鑒定,電泳檢測(cè)結(jié)果均顯示存在一條約2500 bp 的目的基因條帶,表明35S：OsUBA載體構(gòu)建成功。

圖8 ABA 和GA 處理對(duì)OsUBA 表達(dá)的影響 Fig.8 Expression of OsUBA under ABA and GA treatments

圖9 35S:OsUBA 載體的PCR 及雙酶切鑒定 Fig.9 Identification of 35S:OsUBA vector by PCR and double digestion

將35S：OsUBA載體轉(zhuǎn)化水稻日本晴,通過連續(xù)2 代的潮霉素篩選,獲得3 個(gè)帶潮霉素抗性的T2代純合水稻株系(L10、L14 和L15)。提取這3 個(gè)株系和日本晴水稻正常生長10 d 的葉片的總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,利用qRT-PCR 分析OsUBA在各株系中的表達(dá)水平。結(jié)果表明,OsUBA在3 個(gè)過量表達(dá)OsUBA的水稻株系中表達(dá)量都很高,分別是野生型的31.4(L10)、32.4(L14)和38.4(L15)倍(圖10),這些株系可用于后續(xù)對(duì)OsUBA 功能的研究。

2.6 過量表達(dá)OsUBA 水稻株系的開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)

在2016年,本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)OsUBA過表達(dá)株系L15 的開花時(shí)間明顯早于野生型,同時(shí),另2 個(gè)株系L10 和L14 的開花時(shí)間雖晚于L15,但仍比野生型早。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象時(shí)L15 株系大部分已經(jīng)開花,因此未能在2016年完整記錄這些過表達(dá)株系的開花時(shí)間的數(shù)據(jù)。本研究在隨后的2017 和2018 連續(xù)2年繼續(xù)觀察、統(tǒng)計(jì)OsUBA過表達(dá)株系及野生型的開花時(shí)間,獲得了完整的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。整體來看,各株系在這2 個(gè)年度的開花時(shí)間數(shù)據(jù)比較一致：OsUBA過表達(dá)株系中,L15 開花最早,其次是L10,然后是L14；2 個(gè)年度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表明這3 個(gè)OsUBA過表達(dá)水稻株系的開花時(shí)間均明顯早于野生型對(duì)照(圖11)。

2.7 ABA 和GA 處理對(duì)過量表達(dá)OsUBA 水稻株系種子萌發(fā)過程的影響

圖10 過量表達(dá)OsUBA 的水稻株系中OsUBA 的表達(dá)水平分析 Fig.10 Relative expression analysis of OsUBA in OsUBA- overexpressing rice plants

圖11 OsUBA 過表達(dá)水稻株系和野生型的開花時(shí)間比較 Fig.11 Comparison of flowering time between OsUBA-overexpressing rice plants and the wild type control

圖12 ABA 和GA 處理對(duì)OsUBA 過表達(dá)水稻株系和野生型種子萌發(fā)的影響 Fig.12 ABA and GA treatment affects seed germination of OsUBA-overexpressing rice plants and the wild type control

按前述方法研究了在正常生長條件下以及ABA(3 μmol L-1)和GA(100 μmol L-1)處理對(duì)OsUBA過表達(dá)水稻株系及野生型萌發(fā)的影響。結(jié)果表明,OsUBA過表達(dá)水稻株系的種子比野生型萌發(fā)更快,這種差異在萌發(fā)的第1.5 天、2.0 天和2.5 天均非常顯著,此后差距逐漸縮小。3 個(gè)OsUBA過表達(dá)株系中,L10萌發(fā)最快,L15 次之,L14 最慢,但3 個(gè)過表達(dá)株系的萌發(fā)始終比野生型快,到7.5 d 時(shí)所有種子全部萌發(fā)(圖12-A)；ABA 處理均抑制了OsUBA過表達(dá)水稻株 系及野生型種子的萌發(fā),但對(duì)OsUBA過表達(dá)水稻株系的影響更大。在萌發(fā)的第1.5 天影響最顯著,此時(shí),野生型的萌發(fā)率與對(duì)照基本相同,但3 個(gè)OsUBA過表達(dá)株系僅有對(duì)照條件下的 51.4%(L10)、74.9%(L14)和53.5%(L15),可以看出,ABA 對(duì)L10 種子萌發(fā)的抑制效應(yīng)最顯著,對(duì)L14 的影響最小(圖12-C)；GA 處理均促進(jìn)了OsUBA過表達(dá)水稻株系及野生型種子的萌發(fā)。在萌發(fā)的1.5 d,GA 對(duì)野生型的促進(jìn)效應(yīng)比L10 和L15 稍大一些,但對(duì)L14 的促進(jìn)效應(yīng)稍高于野生型,但差異都微乎其微(圖12-B)。以上結(jié)果說明,過表達(dá)OsUBA促進(jìn)了種子的萌發(fā),OsUBA過表達(dá)株系對(duì)ABA 處理更敏感,GA 處理對(duì)OsUBA過表達(dá)株系種子的萌發(fā)稍有促進(jìn),但與野生型相比差異不大。3 個(gè)OsUBA過表達(dá)株系中,L14 的表型最弱。

3 討論

NBR1 類自噬受體通過與ATG8 蛋白間的相互作用參與自噬體膜的形成和延伸[5,7],在自噬過程中扮演重要角色。迄今為止,植物中有關(guān)NBR1 類自 噬受體的研究相對(duì)較少。已有研究表明,擬南芥、煙草等植物中的NBR1 蛋白參與了植物的非生物脅迫反應(yīng)以及對(duì)營養(yǎng)缺乏的響應(yīng)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期有關(guān)小麥中NBR1 蛋白TaUBA 的研究表明,TaUBA 在植物的鹽和干旱脅迫反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用[13]。但水稻中此類蛋白的研究還未見報(bào)道。

本研究表明,OsUBA基因在水稻花藥中的表達(dá)較高(圖7),過量表達(dá)OsUBA的水稻株系開花時(shí)間明顯提前(圖11)。這些結(jié)果說明,OsUBA 可能參與對(duì)水稻開花時(shí)間的調(diào)控。開花是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。在許多植物物種中,開花時(shí)間受到光(光周期)和溫度的精確調(diào)控[17-19]。在OsUBA基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)的G-box 和Sp1 元件是常見的光反應(yīng)元件[20]；此外,該啟動(dòng)子區(qū)還有多個(gè)部分光反應(yīng)元件,如Box 4、GATA-motif、I-box、LAMP- element、chs-CMA1a、chs-CMA2c 等,這些元件常見于光調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū),對(duì)光調(diào)控下基因的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要[21],推測(cè)光照影響OsUBA的表達(dá),進(jìn)而影響轉(zhuǎn)基因水稻的開花時(shí)間。此外,有研究表明,自噬途徑對(duì)花藥發(fā)育中的代謝調(diào)控和營養(yǎng)供應(yīng)非常重要。在擬南芥花粉萌發(fā)過程中,自噬相關(guān)基因ATG6是必需的[22]；在水稻自噬突變體Osatg7-1中,花藥發(fā)育受損[23]；OsATG7在花藥中表達(dá)較高；OsATG7 介導(dǎo)的自噬依賴的脂質(zhì)代謝在花藥發(fā)育中是必需的[24]。本研究中的OsUBA基因編碼選擇性自噬受體,推測(cè)OsUBA 也可能通過自噬途徑介導(dǎo)的能量代謝影響開花時(shí)間。

種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)過程,脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)等的代謝為種子萌發(fā)過程提供能量[25-26]；此外,各類激素在種子萌發(fā)中也發(fā)揮重要作用[27-28],其中,ABA 是種子萌發(fā)的負(fù)調(diào)節(jié)劑[29-30],GA 能促進(jìn)種子萌發(fā)和拮抗ABA 的抑制作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn),OsUBA在萌發(fā)種子的胚中表達(dá)量很高(圖7)；在OsUBA基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了ABA 反應(yīng)元件ABRE 以及 GA 反應(yīng)元件 TATC-box、P-box 和GARE-motif 等；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也表明,ABA 處理顯著抑制OsUBA的表達(dá),GA 處理后OsUBA的表達(dá)略有升高(圖8)；在正常條件下,3 個(gè)過表達(dá)OsUBA水稻株系種子萌發(fā)明顯比野生型快(圖12-A),ABA 處理顯著抑制OsUBA過表達(dá)水稻株系的萌發(fā)(圖12-C),GA 處理對(duì)OsUBA過表達(dá)水稻株系的萌發(fā)稍有促進(jìn)(圖12-B),這些結(jié)果與ABA 和GA 對(duì)OsUBA表達(dá)的影響是一致的,即過量表達(dá)OsUBA促進(jìn)種子的萌發(fā)；ABA 處理抑制OsUBA的表達(dá),進(jìn)而使OsUBA過表達(dá)水稻株系的種子萌發(fā)速率也顯著下降；GA 處理對(duì)OsUBA的表達(dá)略有增強(qiáng),相應(yīng)地,GA 處理后OsUBA過表達(dá)水稻株系的種子萌發(fā)略快,但與野生型間的差異不顯著。此外,也有研究表明自噬途徑參與了種子的萌發(fā)過程。AT1 和AT2 是擬南芥中兩個(gè)與ATG8f 相互作用的蛋白,AT1和AT2在種子發(fā)育的晚期表達(dá)升高；過表達(dá)AT1促進(jìn)了擬南芥種子的萌發(fā)；而抑制AT1的表達(dá)會(huì)延遲種子萌發(fā)過程[32]；在小麥種子萌發(fā)過程中,胚和胚乳中代謝產(chǎn)物的變化差異巨大,在胚乳中,貯藏淀粉及小蛋白類代謝物呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；而在胚中,蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物較多,推測(cè)胚中的能量代謝對(duì)種子的萌發(fā)更重要[33]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,Ntjoka2 的作者曾拿到擬南芥AtNBR1突變體的種子,但他們無法獲得nbr1的純合株系,推測(cè)AtNBR1的突變影響了種子發(fā)育[10]；但令人不解的是,在有關(guān)AtNBR1的研究中,作者得到了nbr1突變體[9]。綜上所述,過量表達(dá)OsUBA促進(jìn)種子萌發(fā),這種影響可能是OsUBA 通過對(duì)ABA 和GA 的合成/反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的；本研究中的OsUBA編碼自噬受體,因此,也有可能是OsUBA 通過自噬介導(dǎo)的能量代謝影響了種子的萌發(fā),抑或是兩者兼而有之。

本研究在OsUBA基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了許多與逆境脅迫有關(guān)的元件,如與缺氧有關(guān)的 GC- motif、與低溫脅迫有關(guān)的LTR 元件以及與ABA 反應(yīng)相關(guān)的ABRE 元件；此外,OsUBA基因的啟動(dòng)子區(qū)還有與MeJA 和SA 有關(guān)的反應(yīng)元件。MeJA 廣泛參與了各種植物逆境脅迫反應(yīng)及與其他激素的相互作用[34]；SA 在植物的抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[35],ABA 與植物非生物脅迫的關(guān)系密切[36],推測(cè)OsUBA 可能也參與植物生物/非生物脅迫反應(yīng)。此前文獻(xiàn)中已有此類蛋白參與植物逆境脅迫反應(yīng)的相關(guān)報(bào)道,如擬南芥中AtNBR1的表達(dá)受熱脅迫誘導(dǎo),nbr1對(duì)熱脅迫的敏感性增強(qiáng),鹽和干旱脅迫抗性降低[9]；小麥中的NBR1 類蛋白TaUBA 也參與了鹽和干旱脅迫反應(yīng)[13]。

在對(duì)OsUBA 及其同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析時(shí),發(fā)現(xiàn)在水稻中除了OsUBA 外還有與之同源的蛋白(圖3)。我們?cè)谇捌谘芯恐性鶕?jù)OsUBA的不同區(qū)域設(shè)計(jì)/構(gòu)建了3 個(gè)RNAi 載體,并分別得到了3 個(gè)載體的純合株系,但遺憾的是各株系的表型與野生型相比差異均不顯著(未發(fā)表數(shù)據(jù)),估計(jì)是因?yàn)橛型吹鞍椎拇嬖?推測(cè)文中提及的水稻中的3 個(gè)NBR1蛋白可能功能冗余；因OsUBA 與OsNBR1 X2 序列相似性更高,兩者的功能可能也更相似。綜上所述,本文中的OsUBA 除了參與對(duì)花期和種子萌發(fā)的調(diào)控外還可能參與植物的非生物/生物脅迫反應(yīng),具有廣泛的生物學(xué)功能,這需要后期進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究克隆了水稻NBR1 類自噬受體蛋白基因OsUBA,該基因的啟動(dòng)子區(qū)含有與各種激素和光反應(yīng)等有關(guān)的順式作用元件。OsUBA基因在各器官中均有表達(dá),但在花藥、根以及萌發(fā)中的種子中表達(dá)量較高,ABA 抑制OsUBA的表達(dá)；OsUBA基因在水稻中的過量表達(dá)使種子萌發(fā)加快、開花時(shí)間提前,ABA 處理顯著抑制了過表達(dá)OsUBA水稻株系種子的萌發(fā),推測(cè)OsUBA基因的表達(dá)和功能可能與花的發(fā)育、種子萌發(fā)以及生物/非生物脅迫反應(yīng)有關(guān)。