常建忠 董春林 張 正 喬麟軼 楊 睿 蔣 丹 張彥琴 楊麗莉 吳佳潔 景蕊蓮

1 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心,山西太原 030031；2 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,山西太原 030031；3 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018；4 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081

逆境相關(guān)蛋白(stress associated protein,SAP)是植物中一類具有A20/AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白。A20鋅指由一個(gè)或多串聯(lián)Cys2/Cys2 鋅指結(jié)構(gòu)組成,首次在人類血管內(nèi)皮細(xì)胞的TNFα-誘導(dǎo)蛋白中發(fā)現(xiàn)[1]；AN1 首次發(fā)現(xiàn)于爪蟾受精卵動(dòng)物半球母系來(lái)源RNA 編碼蛋白中,其結(jié)構(gòu)模式為CX(2)CX(9,12)CX(1,2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC[2]。A20/AN1 鋅指蛋白在動(dòng)物中主要參與免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程[3],在植物中主要參與對(duì)逆境的響應(yīng),故稱作逆境相關(guān)蛋白。

對(duì)植物SAP 相關(guān)基因的研究較為廣泛,在水稻中過(guò)量表達(dá)OsiSAP8可增強(qiáng)花期植株對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性,且不會(huì)造成減產(chǎn)[4]；蒺藜苜蓿MtSAP1基因過(guò)表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因煙草植株中一氧化氮含量顯著增加,從而提高對(duì)滲透脅迫的抗性[5]；擬南芥AtSAP9除參與干旱、低溫、鹽和ABA 脅迫應(yīng)答以外,還可受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),過(guò)表達(dá)該基因?qū)е轮仓陮?duì)ABA 和滲透脅迫的敏感性增加[6]；擬南芥AtSAP13受Cd、ABA 和鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),過(guò)表達(dá)該基因可增強(qiáng)植株對(duì)有毒重金屬(AsIII、Cd 和Zn)、干旱和鹽脅迫的抗性[7]；在干旱條件下,水稻過(guò)表達(dá)獐茅AlSAP基因可增加分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率,進(jìn)而提高產(chǎn)量50%～90%[8]?？梢?jiàn),SAP 基因參與植物對(duì)各種逆境的響應(yīng),且能在一定程度上改善植株抗逆性,但是其作用機(jī)制尚不明確。

內(nèi)含子是斷裂基因中的非編碼序列,通過(guò)選擇性剪接豐富蛋白質(zhì)的多樣性[9],還可以影響宿主基因的表達(dá)[10],這種現(xiàn)象在植物中受到廣泛關(guān)注,已報(bào)道了大量相關(guān)基因,例如玉米Hsp82、Sh1、Adh1、GapA1和Ub1[11-15],水稻OsPB-73、rubi3和OsTub6[16-18],擬南芥MHX、PUX7、PYM和PhADF1[19-21]。擬南芥UBQ10基因啟動(dòng)子與其第一內(nèi)含子融合后使大麥中熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)量增加3 倍[22]。內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的影響并非受單一機(jī)制控制,不同植物或基因的內(nèi)含子可通過(guò)特有機(jī)制調(diào)控宿主基因表達(dá),且不是所有內(nèi)含子都具有這種效應(yīng)[14]。植物SAP 家族一個(gè)顯著特點(diǎn)是大多數(shù)基因編碼區(qū)無(wú)內(nèi)含子,楊樹(shù)和玉米SAP 家族中無(wú)內(nèi)含子的基因分別占80%和90%[23],而5′非翻譯區(qū)常含有內(nèi)含子(5′ untranslated region intron,5UI)[4-5,24-25]。已報(bào)道的研究工作普遍關(guān)注SAP 基因本身的生物學(xué)功能,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道SAP 家族5UI 的功能。小麥TaSAP1參與了植株對(duì)各種逆境的響應(yīng),在擬南芥中過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)植株抵抗干旱等脅迫的能力[26]。我們發(fā)現(xiàn)小麥TaSAP1基因具有2 個(gè)5UI[27],本研究將TaSAP1基因2 個(gè)5UI缺失突變,構(gòu)建表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化二穗短柄草(Brachypodium distachyon),通過(guò)分析GUS 活性水平,研究TaSAP1啟動(dòng)子及其5UI 的生物學(xué)功能,為植物抗逆遺傳育種提供誘導(dǎo)性啟動(dòng)子,也為進(jìn)一步研究TaSAP15UI 功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的“旱選10 號(hào)”克隆TaSAP1啟動(dòng)子；二穗短柄草Bd21,用于遺傳轉(zhuǎn)化和功能驗(yàn)證。利用人工氣候箱種植二穗短柄草,生長(zhǎng)條件為20 h 光照(24 )℃、4 h 黑暗(18 )℃。

選取各載體3 個(gè)陽(yáng)性株系,種植于營(yíng)養(yǎng)缽(7.0 cm × 5.0 cm × 7.8 cm),每缽營(yíng)養(yǎng)土重量一致,并定量給水。植株生長(zhǎng)2 周后進(jìn)行不同脅迫處理,對(duì)于干旱和鹽脅迫,分別在缽中加入10 mL PEG-6000(-0.5 MPa)和NaCl 溶液(250 mmol L-1)；對(duì)于低溫脅迫,將幼苗移入4℃光照培養(yǎng)箱；對(duì)于外源ABA 誘導(dǎo),直接噴灑ABA 溶液(50 μmol L-1)至葉片濕潤(rùn)。以正常生長(zhǎng),無(wú)脅迫處理為對(duì)照。處理8 h 后取樣,液氮速凍,-70℃保存待用。

1.2 TaSAP1 啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

前期利用引物Sap2F/Sap2R已獲得TaSAP1側(cè)翼序列,包含編碼區(qū)510 bp、啟動(dòng)子區(qū)2.5 kb 和3′非翻譯區(qū)1.1 kb,命名為T(mén)aSAP1-A2[27]。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物Tsp1FP1/Tsp1RP0,以含TaSAP1-A2的質(zhì)粒為模板,獲得TaSAP1啟動(dòng)子序列,命名為P1。利用順式作用元件分析工具PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm)和PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動(dòng)子序列,預(yù)測(cè)順式作用元件。

1.3 TaSAP1 啟動(dòng)子5′UTR 內(nèi)含子的缺失及表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物TaspF1/R1(F：5′-CACACATTCATCC TAACCCATT-3′；R：5′-GCGATTCCTCTCCGGCGAT CCCCTAGGAGGGGGAGGACGA-3′)、TaspF2/R2(F：5′-TCGTCCTCCCCCTCCTAGGGGATCGCCGGAGA GGAATCGC-3′；R：5′-GGCTTTGATTTAACTGGAA ATCAG-3′)和TaspF1/R3(F：5′-CACACATTCATCC TAACCCATT-3′；R：5′-GGCTTTGATTTAACTGATA GGAGGAAGCCCTC-3′),正、反向引物5′端分別引入Hind III 和SalI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)。利用引物TaspF1/ R1 和TaspF2/R2,以P1 為模板,進(jìn)行PCR；將回收產(chǎn)物等量混合作為模板,用引物TaspF1/R2 進(jìn)行擴(kuò)增；將回收產(chǎn)物連接到pEAZY-Blunt simple vector,酶切和測(cè)序驗(yàn)證,獲得缺失Intron-1 的啟動(dòng)子片段,命名為-1I。在引物TspR3 5′端引入13 bp 5UI 序列(圖1紅色所示序列)。然后以 P1 為模板,利用引物TspF1/R3 進(jìn)行擴(kuò)增,獲得缺失Intron-2 的片段(-2I)。以-1I 為模板,TspF1/R3 為引物擴(kuò)增,獲得雙內(nèi)含子缺失突變體(Δ2I)。

1.4 二穗短柄草轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性植株檢測(cè)

圖1 TaSAP1 5′UTR 內(nèi)含子缺失突變示意圖 Fig.1 Sketch map of deletion mutation of TaSAP1 5UIs

將正確的P1、-1I、-2I 和Δ2I 重組質(zhì)粒用Hind III 和SalI 雙酶切,和經(jīng)相同內(nèi)切酶處理過(guò)的pCAMBIA1391z(簡(jiǎn)寫(xiě)為P91z)載體片段進(jìn)行連接,經(jīng)酶切測(cè)序驗(yàn)證,構(gòu)建成P91z-P1、P91z-(-1I)、P91z-(-2I)和P91z-Δ2I 重組質(zhì)粒(圖2)。

將上述重組質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1 感受態(tài),培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化二穗短柄草幼胚愈傷組織[28],經(jīng)分化生長(zhǎng)獲得再生植株,利用PCR 和GUS 組織化學(xué)染色的方法篩選陽(yáng)性植株。為使PCR 檢測(cè)更便捷,根據(jù)P1、-1I、-2I 和Δ2I 的共有序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物為714 bp 的引物 TaSP1pf1/r1(F：5′-GCGAAATGCGTCCATAGCG-3′；R：5′-TCGTCGCG ATTCCTCTCCG-3′),用于陽(yáng)性植株的檢測(cè)。

1.5 GUS 組織化學(xué)染色

依據(jù)Jefferson 的方法[29],將待染色短柄草組織放入2.0 mL 離心管,加入X-GLUC 染色液,37℃保溫過(guò)夜,次日取出脫色,體視顯微鏡(LEICA M165FC)下觀察照相。X-GLUC 染色液含64 mL 0.2 mol L-1Na2HPO4,38 mL 0.2 mol L-1NaH2PO4,1 mL 0.1 mol L-1K3[Fe(CN)6],1 mL 0.1 mol L-1K4[Fe(CN)6],4 mL 0.5 mol L-1Na2EDTA,50 mL 甲醇,200 mg X-GLUC 和120 μL Triton-X,定容至250 mL。

圖2 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建示意圖 Fig.2 Sketch map of overexpression vector construction

1.6 GUS 酶活測(cè)定

參照J(rèn)efferson[29]的熒光檢測(cè)法測(cè)定GUS 活性。取0.1 g 樣品于預(yù)冷的研缽中,在液氮中迅速研成粉末,加入1 mL GUS 酶提取液(100 mmol L-1K3PO4,pH 7.8,1 mmol L-1EDTA,1% Triton X-100),用漩渦儀振蕩混勻,16,200 ×g離心10 min,收集上清液,得到GUS 粗酶提取液。以4-MUG 為作用底物進(jìn)行酶促反應(yīng)后,反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)455 nm 條件下,用酶活熒光測(cè)量?jī)x(DQ200)測(cè)定熒光強(qiáng)度,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSAP1 啟動(dòng)子克隆及順式作用元件分析

前期已克隆到TaSAP1啟動(dòng)子序列2.5 kb,其2個(gè)內(nèi)含子位于5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)。將翻譯起始密碼ATG 中的A 定義為+1,Intron-1 和Intron-2 分別位于-967 bp ～ -814 bp 和-771 bp ～ -13 bp。TaSAP1啟動(dòng)子全長(zhǎng)含有多種順式作用元件(圖3),包括基本的調(diào)控元件TATA-box、CAAT-box 等,一些逆境和組織特異表達(dá)相關(guān)順式元件,如ARE、MBS、Skn-1 motif 等(表1)。此外,該基因5′UTR 內(nèi)含子中也存在一些重要元件,如TATA-box、CAAT-box 和ABRE 等。

2.2 TaSAP1 5′UTR 內(nèi)含子的缺失、載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用重疊PCR 對(duì)5′UTR 內(nèi)含子進(jìn)行缺失突變得到-1I、-2I 和Δ2I 三個(gè)缺失片段,將P1 和3 個(gè)內(nèi)含子缺失片段用Hind III 和SalI 雙酶切,與經(jīng)相同酶切的pCAMBIA1391z 連接,通過(guò)酶切檢測(cè)獲得正確的重組質(zhì)粒 P91z-P1、P91z-(-1I)、P91z-(-2I)和P91z-Δ2I(圖4)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化二穗短柄草 幼胚愈傷組織,經(jīng)共培養(yǎng)、潮霉素篩選和分化,獲得再生植株(圖5),PCR 檢測(cè)陽(yáng)性植株,最終獲得含P91z-P1、P91z-(-1I)、P91z-(-2I)和P91z-Δ2I 的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株10、21、17 和24 株。

圖3 TaSAP1 啟動(dòng)子序列及其順式作用元件分布 Fig.3 Sequence and cis-acting elements distribution of TaSAP1 promoter

表1 TaSAP1 啟動(dòng)子主要順式作用元件及預(yù)測(cè)的功能 Table1 Main cis-acting elements and predicted functions in the TaSAP1 promoter sequence

圖4 TaSAP1 5UI 缺失突變及載體構(gòu)建 Fig.4 Deletion mutation of TaSAP1 5UIs and construction of expression vectors

2.3 二穗短柄草GUS 組織化學(xué)染色

轉(zhuǎn)P91z-P1、P91z-(-1I)和P91z-(-2I)短柄草陽(yáng)性 植株各組織化學(xué)染色均為陽(yáng)性(圖6-A),而轉(zhuǎn)P91z- Δ2I 陽(yáng)性植株不能被GUS 著色,可見(jiàn)當(dāng)2 個(gè)內(nèi)含子同時(shí)缺失時(shí),TaSAP1啟動(dòng)子失去活性；轉(zhuǎn)P1 陽(yáng)性植株的GUS 活性是轉(zhuǎn)P91z-(-1I)的2.7 倍,且差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05),而其與轉(zhuǎn)P91z-(-2I)陽(yáng)性植株的GUS 活性之間差異不顯著(P＞0.05)(圖6-B)?？梢?jiàn),Intron-1 可以保證P1 的基本活性。

2.4 不同脅迫條件下的GUS 染色和定量分析

對(duì)轉(zhuǎn)P91z-P1、P91z-(-1I)、P91z-(-2I)和P91z-Δ2I陽(yáng)性植株脅迫處理發(fā)現(xiàn),TaSAP1啟動(dòng)子P1 活性可受干旱、低溫和外源ABA 誘導(dǎo),顯著上調(diào)表達(dá),其中受干旱脅迫上調(diào)表達(dá)程度最高,約是對(duì)照的10 倍(P＜0.01),其次為外源ABA 和低溫(4 )℃分別是對(duì)照的6 倍(P＜0.01)和4 倍(P＜0.05)；轉(zhuǎn)P91z-(-1I)陽(yáng)性植株GUS 活性也可以受以上3 種脅迫誘導(dǎo)上調(diào),分別是對(duì)照的5 倍(P＜0.05)、2 倍(P＜0.05)和4 倍(P＜0.05)；以上各載體陽(yáng)性植株,在NaCl 脅迫下均變化不顯著(P＞0.05)。轉(zhuǎn)P91z-(-2I)陽(yáng)性植株GUS 受不同脅迫處理后,與對(duì)照相比,未見(jiàn)顯著變化(P＞0.05)；轉(zhuǎn)P91z-Δ2I 陽(yáng)性植株對(duì)各種脅迫誘導(dǎo)沒(méi)有響應(yīng),未檢測(cè)到GUS 活性(圖7)。

圖5 二穗短柄草的遺傳轉(zhuǎn)化 Fig.5 Genetic transformation of Brachypodium distachyon

圖6 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性二穗短柄草植株GUS 染色及定量分析 Fig.6 Histochemical staining and quantification of GUS activity in transgenic Brachypodium distachyon

3 討論

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,形成一套復(fù)雜精細(xì)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),能夠在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。啟動(dòng)子是調(diào)控外源基因表達(dá)的主要元件,目前已克隆了相當(dāng)數(shù)量的啟動(dòng)子[20-31],然而啟動(dòng)子主要在轉(zhuǎn)錄水平起作用,調(diào)控方式單一,很難達(dá)到精細(xì)調(diào)控的目的。因此,迫切需要發(fā)掘能夠在多個(gè)水平調(diào)控基因表達(dá)的重要元件。真核生物內(nèi)含子可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯等多水平影響基因表達(dá),是優(yōu)化外源基因表達(dá)的重要元件。大部分內(nèi)含子都位于基因編碼區(qū),如人類約90%的內(nèi)含子位于編碼區(qū)；內(nèi)含子還存在于基因的5′或3′非翻譯區(qū),如人類35%的5′非翻譯區(qū)存在內(nèi)含子[32]。5UI在不同基因家族中分布頻率不等,如起調(diào)控作用的 基因往往富含5UI[32],5UI 在基因中分布的“偏好性”暗示其可能具有某些特殊的功能。此外,5UI 更接近宿主基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),較編碼區(qū)內(nèi)含子更方便調(diào)控基因表達(dá),且序列一般長(zhǎng)于編碼區(qū)內(nèi)含子,可能具有更多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[19],因此5UI 較編碼區(qū)內(nèi)含子更具研究及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖7 TaSAP1 啟動(dòng)子及其內(nèi)含子缺失突變體對(duì)不同逆境的響應(yīng) Fig.7 Response of promoter and 5UI deletion mutants of Ta-SAP1 to different stresses

小麥TaSAP1基因有2 個(gè)5UI[27]。本研究表明TaSAP1啟動(dòng)子P1 屬于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,可受干旱、低溫和外源ABA 脅迫上調(diào)表達(dá),該啟動(dòng)子可用于逆境相關(guān)轉(zhuǎn)基因育種中對(duì)外源基因的精細(xì)調(diào)控；這兩個(gè)5UI 同時(shí)缺失導(dǎo)致TaSAP1啟動(dòng)子失活,單獨(dú)缺失一個(gè)5UI 導(dǎo)致部分功能喪失,其中單獨(dú)缺失Intron-1突變導(dǎo)致P1 活性顯著降低,但不影響P1 對(duì)外界脅迫的響應(yīng),而單獨(dú)缺失Intron-2,對(duì)P1 本身活性無(wú)顯著影響,但失去對(duì)外界脅迫的響應(yīng)能力。說(shuō)明5UI 對(duì)于TaSAP1啟動(dòng)子的功能至關(guān)重要,兩個(gè)5UI 功能不同,Intron-1具有增強(qiáng)P1活性的功能,Intron-2對(duì)于P1 響應(yīng)逆境脅迫非常重要。目前關(guān)于內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的機(jī)制尚未完全揭示,一些內(nèi)含子序列本身具有可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄起始頻率的順式作用元件,如番茄蛋白酶抑制劑II 內(nèi)含子序列[33],但大部分起增強(qiáng)表達(dá)作用的內(nèi)含子并不會(huì)改變基因的轉(zhuǎn)錄起始頻率,這種現(xiàn)象稱作內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)作用(intron- mediated enhancement,IME),IME 產(chǎn)生的機(jī)制相對(duì)復(fù)雜,目前還沒(méi)有被完全解釋。內(nèi)含子參與基因?qū)δ婢车捻憫?yīng)還未見(jiàn)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn)Intron-2參與P1對(duì)逆境的響應(yīng),推測(cè)其可能是由于Intron-2 中存在ABRE、MBS 和CCAAT-box 等逆境相關(guān)順式作用元件。

小麥遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)較難,且周期長(zhǎng),小麥啟動(dòng)子多數(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥來(lái)研究[31,34],小麥和擬南芥分屬單雙子葉植物,遺傳背景差異較大可能會(huì)導(dǎo)致研究誤差,如水稻Actin-1啟動(dòng)子在玉米中活性較高,而煙草中無(wú)活性[35]。二穗短柄草與小麥同屬早熟禾亞科,是研究小麥的理想模式植物[36],本研究利用二穗短柄草為轉(zhuǎn)化受體研究TaSAP1啟動(dòng)子功能,較用擬南芥和煙草,研究結(jié)果更接近真實(shí)情況,更具說(shuō)服力。

4 結(jié)論

小麥TaSAP1啟動(dòng)子P1 可受干旱、低溫和外源ABA 脅迫上調(diào)表達(dá),其中受干旱脅迫上調(diào)表達(dá)程度最高,約是對(duì)照的10 倍；TaSAP15UI 對(duì)于啟動(dòng)子功能發(fā)揮至關(guān)重要,2 個(gè)5UI 均突變可導(dǎo)致P1 失活；Intron-1 具有增強(qiáng)P1 活性的功能,而Intron-2 可使P1 響應(yīng)外界逆境脅迫。