劉博，黃嘉璐，劉立躍

福建省寧德師范學院生命科學學院，352100

白茶（White tea, WT） 是我國的一種特種茶，主要產(chǎn)于福建省福鼎、政和、松溪和建陽等縣，其中福鼎是世界白茶的發(fā)源地，也是中國白茶的主要出口基地。白茶是一種微發(fā)酵茶，其加工工藝簡單，只包括萎凋和干燥兩道工序，既不破壞酶的活性，又不促進氧化作用，因其成品茶多為芽頭，滿披白毫而得名。白茶不僅具有其他茶類含有的茶多酚、兒茶素、維生素、生物堿、氨基酸及揮發(fā)性物質(zhì)等成分[1-2]，而且其茶多酚和兒茶素等有效成分的含量均高于紅茶和黑茶等發(fā)酵茶類[3-4]。白茶和綠茶中的各有效成分含量相近，兩者都具有較高含量的兒茶素，兒茶素是茶類發(fā)揮保健作用的主要活性成分，因而普遍認為這兩類茶具有更好的保健作用[5-6]。

國內(nèi)外已有的研究表明，不同類別的茶葉（包括白茶、紅茶、烏龍茶、綠茶）、不同茶葉組分（如熱水提取液、茶多酚化合物等）對多種腫瘤（肺癌、胃癌、皮膚癌、乳腺癌、肝癌和食道癌等）均有抑制作用[7-8]。阻礙腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡是綠茶及其提取物抑制腫瘤生長的重要途徑[9-10]。然而，有關白茶對腫瘤細胞抑制作用的研究還很少，白茶或其提取物是如何抑制腫瘤細胞增殖的問題有待研究。

本研究以肝癌細胞BEL-7402 株為試驗對象，以 白 茶 水 提 物 （White tea aqueous extract, WTAE）為研究材料，采用DAPI 染色法、TUNEL 法和Caspase-3 活性檢測法等探究WTAE能否導致腫瘤細胞凋亡；利用Real-time PCR法檢測細胞內(nèi)凋亡相關基因的表達水平。

一、材料與方法

1.試驗材料

BEL-7402 細胞購自ATCC 在中國的代理公司；1640培養(yǎng)液為GIBCO公司生產(chǎn)；胎牛血清購自杭州四季青公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAPI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購自江蘇碧云天生物技術有限公司；TRIzol購自TaKaRa公司；Real-time PCR 試劑盒購自Thermo 公司；反轉錄試劑盒購自Fermentas 公司；各兒茶素組分等的標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

2.白茶水提物的準備

白茶（白毫銀針）購自寧德市福鼎某茶葉公司。將2 g 白茶粉放入56℃的100 mL 去離子水中浸泡1 h；取茶湯經(jīng)孔徑為0.45 μm 的濾器過濾后凍干備用。

3.白茶水提物成分分析

采用液相色譜法檢測白茶水提物和白茶中咖啡堿、沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）等成分的含量。具體方法參照國標《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）。色譜柱為C18，用標準品制備標準曲線，各成分含量按標準曲線計算。

4.細胞培養(yǎng)和處理

BEL-7402 細胞采用體積分數(shù)為10%的胎牛血清的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)。當細胞生長成80%融合時，在培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積分數(shù)為0.1%的白茶水提物處理細胞（參照前期研究結果），同時以不含白茶水提物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為對照組。培養(yǎng)不同的時間后收集細胞用于后續(xù)檢測。

5.DAPI染色法檢測細胞核變化

BEL-7402 細胞接種于24 孔板中后，以含0.1%的白茶水提物的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、16、24、48 h后，棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌1～2 遍，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染液染色15 min，再用甲醇漂洗1 次，滴加適量抗熒光淬滅劑后，熒光顯微鏡（Nikon ELIPSE Ts2R）觀察結果并拍照。

6.TUNEL檢測法

采用與前述相同的培養(yǎng)方法培養(yǎng)BEL-7402細胞8、16、24、48 h 后，棄培養(yǎng)液，按TUNEL 檢測試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)DNA斷裂情況，具體操作如下： PBS 潤洗1～2 遍；細胞固定液固定15 min；PBST潤洗3遍；滴加適量的TUNEL檢測液，室溫避光孵育1 h；PBS 洗滌3 次；滴加適量抗淬滅劑，熒光顯微鏡（Nikon ELIPSE Ts2R）下觀察結果并拍照。

7.Caspase-3活性檢測

待BEL-7402細胞生長至80%融合時，以質(zhì)量體積分數(shù)為0.1%的白茶水提物處理細胞8、16、24、36、48 h 后收集細胞，按照Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書檢測Caspase-3的活性。具體操作如下：首先采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測樣品中的蛋白濃度；再用標準品制作標準曲線；將收集的細胞裂解后，離心取上清加入Ac-DEVD-pNA檢測試劑，37℃反應2 h后，酶標儀(Thermo Variokan LUX)讀取OD值；結合標準曲線和蛋白濃度檢測結果計算樣品中Caspase-3的活性。

8.Real-time PCR檢測細胞內(nèi)p53和p21的表達水平

采用Real-time PCR 檢測細胞內(nèi)與凋亡相關基因的表達情況。具體操作如下：首先用預冷的PBS 洗滌細胞3 遍，盡量去除殘留的PBS 后加入TRIzoL裂解細胞并收集樣品，按照試劑盒說明書提取總RNA，再用DNA 酶去除殘留的基因組DNA，采用多功能酶標檢測樣品的OD260∶OD280，分析RNA 純度后，取2 μg 的總RNA 用于反轉錄合成第一鏈cDNA（cDNA 第一鏈合成試劑盒為Fermentas 公司生產(chǎn)，具體操作按照試劑盒說明書）。然后各取1 μL cDNA 為模板，進行Realtime PCR定量分析細胞內(nèi)p53和p21表達水平，所用引物序列如表1（根據(jù)GenBank所提供的各基因的CDNA序列設計），內(nèi)參為GAPDH。

9.統(tǒng)計學方法

應用雙因子方差分析（Two-way ANOVA）進行各試驗組之間的差異分析，結合Dunnett-t 檢驗法分析比較各實驗組與對照組之間的差異。

二、結果與分析

1.白茶和白茶水提物中咖啡堿和各兒茶素組分含量

按照國標法測定WTAE 的提取率為（42.1±4.8）mg/g（表2）。 采用液相色譜法測定WT 和WTAE 中咖啡堿和各兒茶素組分的含量，結果如表2 所示。WTAE 中各成分含量均高于WT。此外，本試驗結果和已有的報道存在差異。

2.細胞核的形態(tài)學變化

BEL-7402 細胞經(jīng)WTAE 處理8、16、24、48 h后，采用DAPI檢測試劑盒檢測細胞核的形態(tài)變化。結果如圖1 所示，在WTAE 作用16 h 后，BEL-7402 細胞的細胞核濃染，細胞核開始濃縮；作用24 h 后，細胞核濃縮較明顯，作用48 h 后，核進一步濃縮，顯示典型凋亡細胞的核特征。由以上試驗結果可知，WTAE能導致BEL-7402出現(xiàn)明顯的細胞凋亡的形態(tài)學特征。

3.WTAE能誘導細胞內(nèi)染色體DNA的降解

采用TUNEL 法檢測白茶作用下BEL-7402 細胞內(nèi)染色體DNA 是否發(fā)生降解。結果（圖2）發(fā)現(xiàn)經(jīng)WTAE處理16 h后，經(jīng)TUNEL標記細胞核出現(xiàn)較弱的熒光信號；24 h熒光信號較為明顯；48 h后信號更為明顯，而各對照組的細胞未見任何標記信號。因此認為，WTAE能導致BEL-7402細胞的染色體DNA發(fā)生降解。

4.WTAE對細胞內(nèi)Caspase-3活性的影響

BEL-7402 細胞用含WTAE 的培養(yǎng)液培養(yǎng)8、16、24、36、48 h 后，收集細胞采用分光光度法檢測細胞內(nèi)的Caspase-3 的活化水平。結果如圖3所示，經(jīng)WTAE 作用8 h 后，細胞內(nèi)Caspase-3 的活性水平明顯升高，且在24 h 活性最高；36 h 后活性下降，但也明顯高于對照組。 Caspase-3 的活性變化符合凋亡細胞內(nèi)Caspase-3 活性變化規(guī)律。

表1 引物序列

圖1 DAPI染色法檢測細胞核的形態(tài)變化（400×）

表2 白茶和白茶水提物成分分析mg/g

圖2 TUNEL法檢測染色體DNA斷裂情況（400×）

5.WTAE對p53和p21表達水平的影響

采用Real-time PCR 檢測WTAE 處理組和對照組細胞內(nèi)p53和p21表達水平。從試驗結果（圖4）可以看出，在WTAE 作用下，BEL-7402 細胞內(nèi)p53 和p21 的mRNA 水平明顯升高，與對照組相比，差異顯著，說明WTAE能使細胞內(nèi)p53和p21表達水平顯著升高。

圖3 BEL-7402細胞內(nèi)Caspase-3的活性變化

圖4 Real-time PCR檢測細胞內(nèi)p53和p21的表達水平

三、討論

福建閩東所產(chǎn)的白茶為非發(fā)酵茶類，其加工過程缺乏發(fā)酵、烘焙以及前期的萎凋等工序，這些工序會使茶葉中的兒茶素轉化成茶黃素和其他復合多酚[11]。因此，白茶中有較高含量的EGCG等具有抗氧化作用的多酚類物質(zhì)[12]，這些物質(zhì)是茶類發(fā)揮保健作用的主要活性成分。由于不同的研究中所采用的白茶的茶葉種類、加工和提取條件等存在差異，因而不同的文獻中所報道的白茶或其提取物中的有效成分含量存在差異。盡管本試驗分析白茶水提物和白茶的有效成分結果和已有的文獻報道存在差異，但也證明了白茶中有較高含量的兒茶素。前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，WTAE 能明顯抑制Hela細胞和BEL-7402細胞的增殖，而且WTAE所導致的死亡細胞結構完整，不能被臺盼藍著色。因此我們懷疑WTAE 所導致腫瘤細胞增殖抑制是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的。在本試驗中，DAPI染色試驗結果發(fā)現(xiàn)，在白茶水提物的作用下，BEL-7402的細胞核出現(xiàn)明顯的濃縮，并且TUNEL法檢測亦顯示在WTAE 作用下，BEL-7402 細胞內(nèi)染色體DNA 出現(xiàn)斷裂。此外，WTAE 還能使細胞內(nèi)Caspase-3的活性顯著升高，以上現(xiàn)象是細胞凋亡發(fā)生的典型特征，因此，誘導腫瘤細胞凋亡是白茶水提物實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖抑制的主要方式。

p53 和p21 是與細胞凋亡有關的重要信號蛋白[13-14]。當細胞遭遇異常情況如DNA受損時，p53表達水平和活化水平會顯著升高，一方面p53 可以阻斷細胞分裂周期導致細胞增殖受阻，另一方面p53可以充當促凋亡蛋白因子（如p21）的轉錄因子，提高其表達水平，引導細胞進入凋亡程序[15-17]。定量PCR 結果發(fā)現(xiàn)WTAE 作用下，BEL-7402 細胞內(nèi)p53 和p21 的表達水平均有升高，說明WTAE 所引起的腫瘤細胞凋亡與p21 和p53有關。但是WTAE是如何活化腫瘤細胞內(nèi)與凋亡相關的信號通路來影響p53 等凋亡相關蛋白因子的表達水平的，有待進一步研究證明。

本項研究證明了WTAE 能通過誘導BEL-7402細胞凋亡而抑制其增殖，為白茶的抗腫瘤保健作用提供重要的理論依據(jù)，并為闡明WTAE 誘導腫瘤細胞凋亡機理奠定了基礎。