于立江 劉怡茜 黃余峰 崔麗華 楊武 陸網(wǎng)坤

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內(nèi)第五大惡性腫瘤，也是最常見(jiàn)的致死性惡性腫瘤[1-2]。HCC組織中BARD1蛋白的表達(dá)和肝癌的病理及預(yù)后有著密切的關(guān)系[3]。BARD1是能與乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCAl)結(jié)合的環(huán)指結(jié)構(gòu)蛋白，其具有指環(huán)樣結(jié)構(gòu)，可與其他蛋白發(fā)生各種聯(lián)系，目前發(fā)現(xiàn)其參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞泛素化等過(guò)程[4]。本研究觀察了影響肝癌組織中BARD1的表達(dá)水平及其與病理、預(yù)后的關(guān)系分析因素，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

2012年1月至2018年12月于醫(yī)院接受治療的肝癌患者105例，另選取50例肝臟手術(shù)標(biāo)本中正常肝臟組織，病理結(jié)果證實(shí)無(wú)癌變肝臟組織作為正常肝臟組織的對(duì)照組，其中肝癌患者：男59例，女46例；年齡37～76歲，平均(59.13±7.83)歲；體質(zhì)量39～82 kg，平均(62.28±8.59)kg；對(duì)照組男26例，女24例；年齡37～77歲，平均(58.87±7.22)歲；體質(zhì)量40～84 kg，平均(60.97±7.98)kg；兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合2000 年中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的《原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)患者術(shù)前均未行化學(xué)治療或放射治療；(3)患者精神正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并艾滋感染和伴其他惡性腫瘤；(3)代謝性腦病、中毒性腦病和顱腦疾病患者；(3)精神病患者及其他原因所致昏迷或精神行為異常者。

二、觀察指標(biāo)及方法

(一)隨訪情況

采用回顧性研究的方法，摘錄患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查信息，以患者住院確診為肝癌的臨床及生化資料為研究資料，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行電話隨訪，直至患者死亡或研究結(jié)束，研究截止時(shí)間為2018年12月30日。

(二)基本資料調(diào)查

通過(guò)本院自制的調(diào)查問(wèn)卷對(duì)接受研究者的一般資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，原則上由患者本人親自填寫，若患者不方便填寫將由護(hù)士或者患者親屬代其填寫。

(三)實(shí)驗(yàn)室檢查

患者確診肝癌后取其肝臟組織細(xì)胞作為研究資料，使用BARD1兔抗人多克隆濃縮型抗體(購(gòu)自美國(guó) abcam 公司；貨號(hào)：2059C4a)使用時(shí)1∶200 PBS液稀釋后按照說(shuō)明書操作。將肝癌組織切片脫蠟過(guò)氧化氫室溫孵育 10 min；使用檸檬酸修復(fù)10 min，山羊血清封閉室溫10 min，加入一抗工作液，放入冰箱 4℃ 過(guò)夜后滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，使用PBS沖洗后，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫 10 min；PBS 沖洗，DAB(DAB 顯色試劑盒購(gòu)自福州邁新試劑公司)顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。用染色好的片子為陽(yáng)性對(duì)照，PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。高倍鏡下隨機(jī)選 4 個(gè)視野以平均灰度值作為染色強(qiáng)度的評(píng)價(jià)BARD1的表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、隨訪結(jié)果

至研究結(jié)束，105例肝癌患者共發(fā)生死亡事件55例，50例患者存活。本研究死亡率為52.3%，存活率為47.7%。

二、兩組肝組織中BARD1的表達(dá)水平

肝癌患者BARD1的表達(dá)水平(105.21±11.21)顯著高于正常組BARD1的表達(dá)水平(75.31±7.25)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。

三、 兩組患者病理特征影響預(yù)后單因素分析

兩組患者男性、年齡≤50歲、吸煙、飲酒、肝硬化幾率、血清 AFP≤25 μg/L比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；生存組出現(xiàn)包膜、腫瘤直徑>5 cm、TNM 分期Ⅲ-Ⅳ、BARD1過(guò)表達(dá)出現(xiàn)幾率 顯著低于死亡組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者病理特征影響預(yù)后單因素分析

四、兩組肝癌患者多因素Logistic分析

以是否發(fā)生肝癌因變量，將單因素篩選有意義項(xiàng)作為自變量并進(jìn)行賦值，將BARD1過(guò)表達(dá)(是=1，否=0)、包膜(有=1，無(wú)=0)、腫瘤直徑≥5 cm(是=1，否=0)、TNM 分期 Ⅲ-Ⅳ(是=1，否=0)、電解質(zhì)紊亂(有=1，無(wú)=0)納入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯BARD1過(guò)表達(dá)、包膜、腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期 Ⅲ-Ⅳ是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表2 乙型肝炎肝硬化失代償期多因素Logistic分析(n,%)

討 論

Sporn等[6]研究表明，完整野生型BARDl是評(píng)估癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物，也證實(shí)正常野生型BARD l的結(jié)腸癌患者預(yù)后好。本研究使用單因素分析得出存活組BARD l過(guò)表達(dá)人數(shù)顯著低于死亡組。使用Logistic回歸分析顯示BARD1過(guò)表達(dá)是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Mcmahon等[7]研究得出BARD1過(guò)表達(dá)是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本研究相一致。

張相國(guó)等[8]研究表明：有包膜的腫瘤，后期的預(yù)后較好。本研究使用單因素分析得出存活組有包膜患者顯著多于無(wú)包膜患者，且使用Logistic回歸分析顯示包膜是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有包膜的腫瘤有一定的活動(dòng)度，表面較光滑，手術(shù)切除時(shí)，容易治愈，且后期預(yù)后較好，惡性腫瘤通常表面無(wú)包膜且不光滑，質(zhì)地堅(jiān)硬，和周圍組織的界線不清楚，后期預(yù)后較差。王建民等[9]研究表明：有無(wú)包膜是腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本研究相一致。

腫瘤的大小往往是決定HCC患者治療方式的關(guān)鍵因素，腫瘤直徑越大治療難度越大、患者生存期越短[10]。本研究使用多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑≥5 cm是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腫瘤直徑越大，分化程度越低，其表達(dá)就越高，手術(shù)切除的風(fēng)險(xiǎn)較大，患者的生存期越短。周延巖[11]研究表明：腫瘤直徑>5.75 cm是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本研究相一致。

TNM分期能夠很好地評(píng)估肝癌手術(shù)切除后的無(wú)瘤生存狀況[12]。本研究使用單因素分析得出存活組TNM 分期 Ⅲ-Ⅳ患者人數(shù)顯著少于死亡組，使用Logistic回歸分析顯示TNM 分期 Ⅲ-Ⅳ是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。王瑞濤等[13]研究表明：TNM 分期是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因，與本研究相一致。

綜上所述，肝癌臟組織中的BARD1表達(dá)顯著高于正常肝組織，BARD1過(guò)表達(dá)、包膜、腫瘤直徑≥5 cm、TNM分期是影響肝癌預(yù)后的重要因素。