班凌偉 謝東 于淑清

鐵蓄積與肝損傷之間有著密切的聯(lián)系。一方面，鐵蓄積會導致或加重肝纖維化、肝細胞瘤，鐵過負荷會增加脂質(zhì)過氧化并易化細胞凋亡[1]；另一方面，很多肝臟疾病都伴隨著鐵蓄積現(xiàn)象的存在，在酒精性肝病和丙型肝炎中，肝臟鐵蓄積是其常見的特性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在慢性活動性肝炎及肝硬化中，鐵主要蓄積在肝小葉外周區(qū)，為肝庫普弗細胞所吞噬，血色病患者的肝纖維化只發(fā)生在肝庫普弗細胞中鐵負荷過重的位置[3]，但是關(guān)于肝庫普弗細胞鐵蓄積與肝損傷關(guān)系的研究很少。因此，本課題通過對模型小鼠與正常小鼠注射CCl4造成急性肝損傷，來研究肝庫普弗細胞鐵蓄積是否會加重肝損傷，探討肝庫普弗細胞在其中發(fā)揮的作用，為進一步揭示鐵蓄積與肝損傷的聯(lián)系機制提供參考。

鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroportin，F(xiàn)PN)是目前唯一已知的鐵輸出蛋白[4]。肝庫普弗細胞是分布于肝臟中的一種巨噬細胞，在鐵離子代謝中，吞噬衰老的紅細胞而獲得鐵離子，在FPN的作用下將鐵離子轉(zhuǎn)運出細胞[5]。巨噬細胞FPN敲除是利用Cre/loxP系統(tǒng)，使FPN只在小鼠巨噬細胞特異性敲除，使巨噬細胞鐵無法轉(zhuǎn)運出，造成巨噬細胞鐵蓄積，而肝庫普弗細胞是巨噬細胞的一種，因此本課題采用巨噬細胞FPN敲除小鼠作為肝庫普弗細胞鐵蓄積模型小鼠。CCl4作為經(jīng)典的劇毒類親肝毒物，對各種動物均可導致肝臟損傷，是常用的動物急性肝損傷模型[6]。

資料與方法

一、研究對象

雄性清潔級FPN-/-cre小鼠(肝庫普弗細胞鐵蓄積小鼠)和FPN-/-小鼠(正常小鼠)各16只，8周齡，體重(23～26)g。分別隨機分為兩組：FPN-/-cre小鼠對照組和實驗組；FPN-/-小鼠對照組和實驗組；每組8只。

二、實驗方法

(一)CCl4急性肝損傷模型的建立：對照組：橄欖油5 μL/g；實驗組：0.25% CCl45 μL/g；全部采用腹腔注射。

(二)標本的收集及肝勻漿的制備：禁食不禁水，24 h后稱取小鼠體重；取血測定血清中ALT、AST水平；處死小鼠，稱取完整肝臟重量，計算肝臟指數(shù)；取一部分肝組織制成10%肝臟組織勻漿，測定肝組織MDA、SOD、GSH含量。

(三)肝臟組織病理學觀察：取較為規(guī)則的一部分肝組織，經(jīng)過固定、包被、包埋、切片處理后，HE染色，顯微鏡進行觀察。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST變化

兩實驗組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST均高于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明經(jīng)CCl4處理后，兩組小鼠肝臟均增大，CCl4建模成功。兩對照組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FPN-/-cre實驗組肝臟指數(shù)、血清ALT、AST高于FPN-/-實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因此在相同的CCl4處理下，F(xiàn)PN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝臟體積更大，肝損傷更嚴重。見表1。

表1 小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST比較(±s，n=8)

注：與FPN-/-對照組相比，aP<0.05；與FPN-/-cre對照組相比，bP<0.05；與FPN-/-實驗組相比，cP<0.05

二、小鼠肝組織MDA、SOD、GSH變化

兩實驗組MDA水平均高于其對照組，SOD、GSH水平均低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)CCl4處理后，兩種小鼠肝臟受到氧化損傷，CCl4建模成功。兩對照組MDA、SOD、GSH水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FPN-/-cre實驗組MDA水平高于FPN-/-實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FPN-/-cre實驗組SOD、GSH水平低于FPN-/-實驗組，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在相同的CCl4處理下，F(xiàn)PN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝臟氧化損傷更嚴重，主要表現(xiàn)為MDA增加(見表2)。

表2 小鼠肝臟MDA、SOD、GSH比較(±s，n=8)(nmol/mgprot)

注：與FPN-/-對照組相比，aP<0.05；與FPN-/-cre對照組相比，bP<0.05；與FPN-/-實驗組相比，cP<0.05

三、小鼠肝臟病理學情況

兩對照組肝細胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，排列有序，胞漿致密，核大而圓，兩組沒有顯著差異。FPN-/-實驗組肝細胞結(jié)構(gòu)破裂，排列紊亂，包漿出現(xiàn)松散。FPN-/-cre實驗組肝細胞結(jié)構(gòu)破裂、溶解，排列雜亂，包漿嚴重松散，局部還出現(xiàn)了出血點現(xiàn)象，是肝損傷的顯著標志。說明在同樣的CCl4處理下，F(xiàn)PN-/-cre小鼠比FPN-/-小鼠肝損傷更嚴重。見圖1。

注：A為FPN-/-對照組，B為FPN-/-cre對照組，C為FPN-/-實驗組，D為FPN-/-cre實驗組

圖1小鼠HE染色情況比較

討 論

肝臟指數(shù)是肝臟毒性試驗觀察中的重要指標，肝臟指數(shù)越大，表明肝損傷越重[7]。當肝細胞受損變性、細胞膜通透性增加時，從細胞內(nèi)溢出的主要是血清ALT，當肝細胞嚴重病變、壞死時，線粒體內(nèi)的AST會釋放到血液中。在鐵蓄積影響肝損傷的實驗研究中，大部分文獻報道不同原因的肝臟鐵蓄積均會使肝臟指數(shù)增大，血清ALT、AST水平升高，肝損傷加重[8]。本實驗中，在相同的CCl4處理下，F(xiàn)PN-/-cre小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT、AST水平顯著性大于FPN-/-小鼠，說明與其他原因引起的肝臟鐵蓄積一樣，肝庫普弗細胞鐵蓄積同樣會加重肝損傷。證實了肝庫普弗細胞在鐵蓄積與肝損傷關(guān)系中的重要性，也一定程度上解釋了部分患者的肝纖維化只發(fā)生在肝庫普弗細胞中鐵負荷過重位置的現(xiàn)象。

很多機制推測解釋鐵蓄積影響肝損傷的原因，包括增加氧自由基，通過星狀細胞激活纖維形成，損害免疫反應等。二價鐵離子會與脂質(zhì)過氧化物反應產(chǎn)生自由基，這些自由基會氧化各種細胞成分，導致細胞凋亡或其他細胞傷害，造成肝細胞損傷、肝纖維化

的發(fā)生。MDA是過氧化損傷的標志產(chǎn)物，其含量的高低可以靈敏的反映肝損傷強烈程度；SOD是一種存在于細胞液中的抗氧化酶，其活性的高低可間接反映機體抗氧化能力的強弱；GSH是細胞內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，可清除O2-、H2O2等過氧化物[9]。在鐵蓄積影響肝損傷的實驗研究中，大部分文獻報道鐵蓄積會使小鼠肝臟MDA水平升高，SOD、GSH水平降低，肝臟氧化損傷加重[10]。本實驗中，在相同的CCl4處理下，與FPN-/-小鼠相比，F(xiàn)PN-/-cre小鼠肝臟MDA水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義，SOD、GSH水平降低，差異不具有統(tǒng)計學意義。說明與其他原因的鐵蓄積影響肝損傷相比，肝庫普弗細胞鐵蓄積確實加重了肝臟的氧化損傷程度，主要表現(xiàn)為過氧化損傷產(chǎn)物MDA的生成增加，而抗氧化劑SOD、GSH的分泌無明顯增加，可能是機體對過氧化物的清除作用尚無明顯差異。在肝庫普弗細胞鐵蓄積加重肝損傷的過程中，鐵的過氧化可能具有一定作用，但具體機制仍需進一步探討。