李梅

(山東大學第二醫(yī)院，濟南250033)

牽張成骨術(shù)起源于矯形外科，是一類內(nèi)源性的組織工程技術(shù)，既避免了供區(qū)創(chuàng)傷又可使軟組織同步延長，廣泛應(yīng)用于臨床頜面骨矯形手術(shù)和骨缺損矯形手術(shù)，有創(chuàng)傷小、無需植骨、不發(fā)生排斥反應(yīng)、面部軟硬組織比例協(xié)調(diào)、避免二次手術(shù)等優(yōu)點。1992年牽張成骨技術(shù)首次應(yīng)用于先天下頜畸形的治療，然而其存在治療周期長、新生骨組織礦化水平較差等問題[1]。因此，促進牽張間隙的新骨形成及礦化、縮短牽張后的固定期成為學者們研究的方向。骨組織的新陳代謝和新生作用受到神經(jīng)的支配。臂板蛋白3A是一種神經(jīng)軸突導向性分子，是成骨細胞分泌的一種蛋白，具有調(diào)節(jié)成骨細胞生理活動的作用，并可直接或間接調(diào)節(jié)骨骼的新生和改建。2017年1～5月，本研究觀察了臂板蛋白3A對兔下頜骨牽張成骨的成骨效應(yīng)的影響，以期為提高牽張間隙內(nèi)的成骨質(zhì)量、縮短牽張成骨治療周期提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與主要器材 純種新西蘭大白兔20只，5～6月齡，體質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，由山東大學第二醫(yī)院實驗動物中心提供。鈦合金內(nèi)置式牽張器及鈦合金螺絲，臂板蛋白3A，頜骨微動力系統(tǒng)，iDXA，力學測試裝置。

1.2 下頜骨牽張成骨模型制作及臂板蛋白3A用法 對20只新西蘭大白兔行右側(cè)下頜骨牽張成骨術(shù)。術(shù)前實驗兔禁水禁食8 h，稱重并記錄，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)。頭取側(cè)仰位，暴露左側(cè)下頜部，備皮，加用2%鹽酸利多卡因局部浸潤麻醉，消毒，鋪巾。于實驗兔下頜角前方、下頜骨下緣下方1 cm暴露下頜骨，暴露頦孔及頦神經(jīng)；在下切牙后方0.5～1 cm處切開下頜骨上2/3，固定牽張器使其與骨面貼合；再切開下頜骨下緣1/3，使下頜骨完全離斷；充分止血后分層縫合創(chuàng)口，術(shù)后給予10%葡萄糖80 mL加160萬單位青霉素連續(xù)靜滴7 d。延遲期為6 d，于術(shù)后第7天開始牽張，牽張期連續(xù)10 d，每天10：00和20：00各牽張0.4 mm，至牽張結(jié)束時共延長8 mm。將20只兔隨機分為A、B兩組，每組10只。A組為空白對照，模擬常規(guī)牽張成骨術(shù)后的組織再生過程。B組于牽張期第1、5、10天在牽張間隙內(nèi)注射臂板蛋白3A(500 μg/kg)。牽張過程結(jié)束后進入固定期。20只兔全部存活，均出現(xiàn)偏頜，1只兔牽張器螺旋桿在延遲期內(nèi)埋入皮下，經(jīng)二次手術(shù)后重新暴露并固定。所有牽張器均固定穩(wěn)固、無松動。牽張間隙處骨組織有明顯增厚，表面有軟組織附著。分別于固定期第2、6周，各組隨機處死5只動物，取右側(cè)下頜骨標本，以備后續(xù)實驗。

1.3 下頜骨影像學檢查 獲得下頜骨標本后采用X線檢查(50 kV，6 mA，0.06 s)，觀察下頜骨形態(tài)。所獲取的圖像信息通過DVD刻錄保存。

1.4 牽張區(qū)骨組織觀察 距牽張間隙約1 cm截取牽張區(qū)及相鄰的骨組織，標本浸泡在4%的中性甲醛緩沖溶液中48 h固定，然后采用10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣4周，脫鈣期間每3 d更換1次EDTA溶液。脫鈣之后的組織經(jīng)過沖洗、梯度乙醇脫水及石蠟包埋后，沿著下頜骨的長軸方向進行組織切片，切片厚度為4 μm，不連續(xù)切片，每個標本制作6張切片，HE染色觀察。

1.5 骨小梁寬度(TNTB)、新生骨數(shù)量(NBV)測算 采用圖像分析軟件Image-Pro Puls6.0進行骨組織形態(tài)計量分析。6張切片每張的牽張間隙內(nèi)隨機選擇20個新生骨小梁，在每個新生骨小梁上隨機測量5處骨小梁寬度，該骨小梁的寬度為所測量5處的均值，20個新生骨小梁寬度的均值即為該張切片的TNTB。對牽張間隙內(nèi)新生骨骼組織的面積進行測定，包括皮質(zhì)區(qū)新生骨骨量(NBV1)和松質(zhì)區(qū)新生骨骨量(NBV2)，每個標本均測量6張不連續(xù)切片，取均值。

1.6 成骨區(qū)骨密度(BMD)、骨礦物質(zhì)含量(BMC)檢測 使用iDXA設(shè)備，調(diào)節(jié)到高分辨率、小型動物模式。用DXA掃描暫時浸泡于去離子水的下頜骨樣本，將成骨區(qū)域設(shè)定為興趣區(qū)，掃描后得到BMD和BMC。

1.7 成骨區(qū)生物力學指標檢測 使用力學測試裝置對兩組下頜骨成骨區(qū)進行三點彎曲實驗。受力區(qū)域受到1 mm/min的連續(xù)擠壓，直到斷裂，繪制載荷變形曲線圖，并記錄成骨區(qū)最大載荷(成骨區(qū)能承受的最大力)、剛度(載荷變形曲線斜率)和總能量吸收(成骨區(qū)壓縮過程中吸收的總能量)。

2 結(jié)果

2.1 下頜骨X線檢查結(jié)果 去除牽張器后，僅有A組在固定期第2周處死的1只大白兔下頜骨骨斷端稍有活動度，約1 mm。在固定期第2周，A組X線檢查顯示顯著的下頜骨斷開痕跡，在牽張間隙中隱約可見骨骼低密度影像學特征，骨皮質(zhì)無連續(xù)性(圖1A)；B組亦可見顯著的切開痕跡，下頜骨上部和下部邊緣的部分區(qū)域模糊顯示早期骨皮質(zhì)成骨特征，部分區(qū)域的骨密度與周圍正常骨質(zhì)接近，不易區(qū)分(圖1B)。在固定期第6周，A組X線檢查示骨切開斷端痕跡不清晰，下頜骨下緣區(qū)域形成早期皮質(zhì)骨，牽張間隙內(nèi)可見明顯的成骨影像(圖2A)；B組骨切開斷端密度與周圍正常骨皮質(zhì)基本一致，不易辨認，牽張間隙內(nèi)新骨礦化程度較好，骨斷端完全愈合，下頜骨被延長(圖2B)。

注：A為A組；B為B組。

圖1 牽張成骨固定期第2周時兩組下頜骨本X線影像

注：A為A組；B為B組。

圖2 牽張成骨固定期第6周時兩組下頜骨標本X線影像

2.2 兩組牽張區(qū)骨組織形態(tài)變化 固定期第2周時，A組與牽張方向相同的骨細胞被拉長，膠原纖維平行排列，可見新的較細的骨小梁結(jié)構(gòu)，表面覆蓋了大量的成骨細胞(圖3A)；B組有少量平行排列的膠原纖維組織，新生骨小梁內(nèi)可見小血管生成，部分區(qū)域可以觀察到骨小梁較為粗大，且骨小梁周圍分布著大量的成骨細胞(圖3B)。固定期第6周時，A組沿牽引方向生有較多的新生骨組織，髓腔中可以發(fā)現(xiàn)圓形基質(zhì)細胞，內(nèi)部膠原纖維基本消失，可見骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖4A)；B組牽張區(qū)域內(nèi)有密集的骨小梁排布，且骨小梁較粗大，可見成熟的骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖4B)。

注：A為A組；B為B組。

圖3 牽張成骨固定期第2周時兩組下頜骨牽張區(qū)骨組織形態(tài)(HE染色)

2.3 兩組成骨區(qū)TNTB、NBV比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時成骨區(qū)TNTB、NBV均高于同組第2周時，相同檢測時點B組成骨區(qū)TNTB、NBV高于A組(P均<0.05)。詳見表1。

注：A為A組；B為B組。

圖4 牽張成骨固定期第6周時兩組下頜骨牽張區(qū)骨組織形態(tài)(HE染色)表1 牽張成骨固定期第2、6周時兩組成骨區(qū)TNTB、NBV比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時點相比，#P<0.05。

2.4 兩組成骨區(qū)BMD、BMC比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時成骨區(qū)BMD、BMC均高于同組第2周時，B組第6周時BMD、BMC高于同期A組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 牽張成骨固定期第2、6周時兩組成骨區(qū)BMD、BMC比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時點相比，#P<0.05。

2.5 兩組成骨區(qū)生物力學指標比較 A、B組牽張成骨固定期第6周時成骨區(qū)硬度、最大載荷、能量吸收均高于同組第2周時，且相同檢測時點B組高于A組(P均<0.05)。詳見表3。

表3 牽張成骨固定期第2、6周時兩組成骨區(qū)生物力學指標比較

注：與同組第2周相比，*P<0.05；與A組同時點相比，#P<0.05。

3 討論

牽張成骨技術(shù)的主要原理為：將骨切斷但仍保留骨膜和周圍軟組織，對骨骼組織按一定方向施加適當、穩(wěn)定的牽引力，激活成骨細胞的骨細胞增殖功能，使骨組織再生。牽張過程中，新骨在牽張間隙內(nèi)形成并礦化，同時周圍血管、神經(jīng)等軟組織也同步擴張。牽張成骨技術(shù)有創(chuàng)傷小、無需植骨、不發(fā)生排斥反應(yīng)、面部軟硬組織比例協(xié)調(diào)、避免二次手術(shù)等優(yōu)點。然而由于多種技術(shù)尚未成熟，牽張成骨治療耗時較長，新生骨組織可能會因牽張速度控制不好而造成礦化水平差等問題。上述兩方面是限制牽張成骨技術(shù)臨床推廣的關(guān)鍵問題，需要更加深入的探索和研究。為促進牽張間隙的新骨形成及礦化、縮短牽張后的固定期，學者們不斷嘗試新的技術(shù)手段，包括應(yīng)用脫礦骨基質(zhì)、高壓氧、干細胞、細胞因子等，在相關(guān)實驗中取得一定效果，但均未在臨床推廣使用。

骨的改建包括成骨細胞介導的新骨形成和破骨細胞介導的骨礦物質(zhì)吸收，同時體液的配合會加速新骨的礦化及骨小梁的重新排列。臨床研究發(fā)現(xiàn)，健康成年人的骨骼吸收和重新生成速度達到平衡，如果這個過程失衡就會引起某些骨骼疾病的發(fā)生[2，3]。目前，大多數(shù)藥物是通過靶向抑制破骨細胞的生成來降低破骨細胞的骨吸收作用，如破骨細胞分化因子抑制劑。但是，由于破骨細胞的骨吸收作用和成骨細胞的骨形成作用之間具有相關(guān)性，此類藥物在抑制骨吸收作用的同時也可導致新骨形成減少。

臂板蛋白是由分泌型和細胞膜偶聯(lián)型蛋白組成的家族，是神經(jīng)軸突導向因子的原型[4]。而作為一種趨化生長因子的臂板蛋白3A，其不僅在胚胎期動物脊髓中有表達，在成年動物組織中亦有表達，可參與多種生理過程，并起到重要的調(diào)節(jié)作用[5～8]。臂板蛋白3A是目前發(fā)現(xiàn)的最強的軸突誘導分子，已被證實參與神經(jīng)系統(tǒng)主要結(jié)構(gòu)如腦、脊髓和周圍神經(jīng)的形成，成人神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)(如軸突再生和神經(jīng)修復)。臂板蛋白3A及其受體在骨細胞、成骨細胞和破骨細胞中都有表達。研究發(fā)現(xiàn)，對健康成年大鼠注射臂板蛋白3A后可促進成骨細胞生成，破骨細胞數(shù)量有所減少；而對于骨骼缺損的成年鼠可使骨量增加，在去勢大鼠中會導致骨吸收減少[9]。臂板蛋白3A對破骨細胞和成骨細胞起著雙重作用，是一種潛在的骨病治療藥物。也有研究[10]表明，臂板蛋白3A可對促進新骨生成，同時會抑制破骨細胞的生成。有學者[11]觀察缺乏臂板蛋白3A的小鼠，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)骨質(zhì)破壞和骨合成調(diào)節(jié)因子、成骨細胞數(shù)量減少，表現(xiàn)為骨和軟骨發(fā)育不良、結(jié)構(gòu)異常等，提示臂板蛋白3A可能通過某種機制間接調(diào)節(jié)骨的形成。破骨細胞可經(jīng)核因子受體活化因子配體誘導生成，而臂板蛋白3A分泌的骨保護素(OPG)對破骨細胞分化因子的活性有抑制作用，從而抑制破骨細胞的合成。當臂板蛋白3A缺乏時，破骨細胞分化信號可促進破骨細胞分化，增加骨質(zhì)的破壞吸收[12～14]。臂板蛋白3A可阻斷OPG缺乏的條件性小鼠顱骨細胞中破骨細胞的形成，且缺乏臂板蛋白3A的小鼠表現(xiàn)明顯的骨量缺乏，從而證明臂板蛋白3A能抑制破骨細胞生成[15]。

常規(guī)牽張成骨建立模型時，通常先將骨完全切斷，再固定牽張器，這種方式骨斷端不能完全對齊，長軸方向亦可能發(fā)生變化，不易與牽張器完全貼合，使牽張器螺旋桿旋轉(zhuǎn)阻力增大，致使后期骨骼愈合時發(fā)生錯位、彎曲、變形，導致建模失敗。本次實驗在建立牽張成骨模型時進行了創(chuàng)新，先用來復鋸將兔下頜骨上2/3切開，確定牽張器安放位置及螺旋桿穿出皮膚的位置，使牽張器與骨壁完全貼合，打孔并用螺絲固定牽張器后，再完全截斷骨骼。這樣可使離斷的骨骼保持原有的長軸方向，牽張成骨后，骨段只在原有的長軸方向增長，提高了手術(shù)的成功率。本研究借助X線檢查、骨組織形態(tài)觀察、DXA掃描、生物力學實驗，旨在觀察臂板蛋白3A對成骨效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著時間推移，兩組的牽張間隙內(nèi)均有新骨形成并礦化，B組成骨情況優(yōu)于A組；A、B組牽張成骨固定期第6周時成骨區(qū)TNTB、NBV及成骨區(qū)硬度、最大載荷、能量吸收均高于同組第2周時，相同檢測時點B組高于A組；A、B組牽張成骨固定期第6周時成骨區(qū)BMD、BMC均高于同組第2周時，B組第6周時BMD、BMC高于同期A組。上述結(jié)果提示，外源性臂板蛋白3A能夠促進兔下頜骨牽張間隙的愈合，促進新骨形成，提高成骨效應(yīng)，縮短治療周期。臂板蛋白3A在臨床治療中有較好的應(yīng)用前景，以上結(jié)果為頜面部畸形矯正治療提供了新的思路。