鄭俊雅，張珍，劉增瑞，李濟(jì)君，李魯新，初彥輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011)

微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA，長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，它參與調(diào)控細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡和分化等眾多生物學(xué)途徑，并且與心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病及免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1]。miR-23b是miRNA家族成員之一，與調(diào)控腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病、病毒感染等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[2]，在調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中同樣發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是miR-23b的靶基因[3]。ASK1作為c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)上游調(diào)節(jié)激酶，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、腎間質(zhì)纖維化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)[4]。miR-23b可抑制p38 MAPK-NF-κB炎癥信號(hào)通路的活性，減輕巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。白介素17(IL-17)可下調(diào)人成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞、小鼠腎原代細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-23b的表達(dá)；反之，miR-23b可抑制IL-17、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的活化和炎癥因子表達(dá)，從而抑制自身免疫性炎癥。但miR-23b是否直接參與到脂多糖(LPS)介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控目前尚不清楚，有待進(jìn)一步闡明。2018年4月～2019年1月，本研究觀察了miR-23b表達(dá)變化對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 小鼠巨噬細(xì)胞株J774A.1購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。LPS購(gòu)于Sigma公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invireogen公司。miR-23b類似物(miR-23b mimics)及miR-23b抑制劑(miR-23b inhibitor)均購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司。RNA提取試劑盒購(gòu)于Omega公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche公司。引物購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。IKKα抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 LPS作用濃度篩選 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)J774A.1細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。將細(xì)胞接種于6孔板，分別給予0、0.1、0.5、1、5、10 μg /mL的LPS處理12 h。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，不同濃度LPS處理的J774A.1細(xì)胞均出現(xiàn)顯著的活化形態(tài)特征，即細(xì)胞體積增大、胞突伸展、出現(xiàn)偽足。采用qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中的炎癥相關(guān)因子NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA，0.5、1、5、10 μg /mL的LPS處理的細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞(P均<0.01)。見表1。Western blotting法檢測(cè)IKKα蛋白，0.1、0.5、1、5、10 μg/mL的LPS處理的細(xì)胞中IKKα蛋白相對(duì)表達(dá)量高于未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞(分別為1.54±0.06、3.10±0.26、3.27±0.21、2.82±0.17、2.25±0.24、1.03±0.03，P均<0.01)。選擇1 μg/mL為L(zhǎng)PS的適宜作用濃度。

表1 不同濃度LPS處理后巨噬細(xì)胞中p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較

注：與0 μg/mL LPS相比，*P<0.05，**P<0.01。

1.3 巨噬細(xì)胞分組及miR-23b類似物、抑制劑轉(zhuǎn)染 將巨噬細(xì)胞分為miR-23b mimics組、陰性對(duì)照1組和miR-23b inhibitor組、陰性對(duì)照2組，接種于6孔板。將miR-23b mimics、miR-23b inhibitor、mimics control、inhibitor control的凍干粉分別用無RNase水溶解。加入2.5 μL的LipofectamineTM2000到100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，輕彈混勻后室溫靜置5 min，分別加入miR-23b mimics、mimics control和miR-23b inhibitor、inhibitor control，混勻后于室溫條件下靜置25 min。各組細(xì)胞換成2 mL新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基，之后分別加入提前配置的相應(yīng)轉(zhuǎn)染液，試劑終濃度為50 nmol/L。將6孔板放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染3 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并加入1 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液及細(xì)胞備檢。采用qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中的miR-23b，miR-23b mimics組、陰性對(duì)照1組和miR-23b inhibitor組、陰性對(duì)照2組miR-23b相對(duì)表達(dá)量分別為5.56±0.41、1.04±0.02和0.36±0.03、1.02±0.03。miR-23b mimics組miR-23b表達(dá)水平高于陰性對(duì)照1組，miR-23b inhibitor組miR-23b表達(dá)水平低于陰性對(duì)照2組(P均<0.01)，表明miR-23b mimics、miR-23b inhibitor均轉(zhuǎn)染成功。

1.4 巨噬細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA檢測(cè) 采用qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中的NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA。細(xì)胞總RNA的提取按照RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行，用Nanodrop 2000測(cè)定總RNA純度和濃度。取A260/A280為1.8～2.0的RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行，以合成后的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 34 s、共40個(gè)PCR循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因引物序列見表2。

表2 NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6基因及內(nèi)參基因引物序列

2 結(jié)果

miR-23b mimics組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照1組(P均<0.01)。見表3。miR-23b inhibitor組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照2組(P均<0.01)。見表4。

表3 miR-23b mimics組、陰性對(duì)照1組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較

注：與陰性對(duì)照1組相比，*P<0.01。

表4 miR-23b inhibitor組、陰性對(duì)照2組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)比較

注：與陰性對(duì)照2組相比，*P<0.01。

3 討論

炎癥反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是機(jī)體組織受外界刺激時(shí)所產(chǎn)生的一種保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)伴隨著促炎因子的釋放[5]。正常情況下，機(jī)體內(nèi)的促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使機(jī)體免疫防御功能得以穩(wěn)定。巨噬細(xì)胞屬于機(jī)體免疫細(xì)胞的一種，當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)快速且非特異性地對(duì)損傷作出反應(yīng)，這對(duì)于激活機(jī)體固有免疫和獲得性免疫都是非常重要的[6]。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，是自身免疫和自身炎癥性疾病中炎癥介質(zhì)的主要產(chǎn)生者。巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子參與介導(dǎo)多個(gè)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)展；巨噬細(xì)胞還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7～9]。

LPS是一種革蘭陰性菌的表面抗原物質(zhì)，是多種噬菌體吸附的受體，能夠激發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)臨床內(nèi)毒素血癥的產(chǎn)生[10]。LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要由Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)，TLR4被激活后通過與分子伴侶熱休克蛋白60結(jié)合，激活NF-κB，誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞并產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥因子[11]。LPS模型是經(jīng)典的炎癥模型。LPS刺激靶細(xì)胞后，通過NF-κB介導(dǎo)促炎癥基因細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)上調(diào)，ICAM-1又可反過來調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)，從而使炎癥信號(hào)和炎癥因子被持續(xù)激活和釋放[12]。

miRNA是一類能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的小分子。miRNA可以參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及細(xì)胞黏附等多方面均能發(fā)揮重要作用[13,14]。有報(bào)道指出，miR-23b在自身免疫疾病中表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為可能是炎性疾病的治療靶點(diǎn)。miR-23b可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的途徑調(diào)控多種自身免疫性疾病，影響炎癥因子如NF-κB、TNF-α、IL-17等的產(chǎn)生。在免疫性炎癥疾病中，miR-23b通過靶向調(diào)節(jié)NF-κB下游信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子TGF-β活化激酶結(jié)合蛋白2、TGF-β活化激酶結(jié)合蛋白3、IKKα等抑制IL-17/TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化和炎癥因子表達(dá)[15]。miR-23b不僅可以通過抑制IL-17產(chǎn)生，參與相關(guān)自身免疫性炎癥的發(fā)生，還可抑制Th1、Th17向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，抑制自身免疫性腦脊髓炎的病程[16]。miR-23b已被證明能夠抑制感染性疾病中的炎癥反應(yīng)，并可在膿毒性休克期間抑制血管內(nèi)皮功能[17]。研究報(bào)道，抑制miR-23b表達(dá)可顯著改善心臟功能，有助于減輕膿毒癥后期心肌纖維化的激活[18]。近期研究發(fā)現(xiàn),miR-23b可通過減輕炎癥反應(yīng)治療敗血癥誘發(fā)的心肌病，其作用機(jī)制可能是miR-23b抑制NF-κB激活，降低TNF受體關(guān)聯(lián)因子6和IKKβ表達(dá)水平，減少細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果表明miR-23b有望為膿毒癥引起的心肌病的治療提供新的方向。

本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，miR-23b可能是一種有效的皮膚傷口愈合劑，其可以靶向細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)抑制炎癥反應(yīng)，縮短炎癥反應(yīng)周期，促進(jìn)皮膚傷口愈合。多種應(yīng)激損傷及促炎因子均可激活A(yù)SK1，而活化的ASK1又可激活MKK3/MKK6-P38及MKK-4/MKK7-JNK激酶途徑，進(jìn)而對(duì)下游p38 MAPK及JNK信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，對(duì)MAPK激酶3和MAPK激酶4做出免疫應(yīng)答，導(dǎo)致促纖維化和促炎因子的產(chǎn)生[19]。有研究表明，miR-23b可抑制p38 MAPK-NF-κB炎癥信號(hào)通路活性，減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)及炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，減輕腎組織的炎癥性損傷[20]。因此我們推測(cè)miR-23b可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。本研究結(jié)果顯示，miR-23b mimics組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照1組，miR-23b inhibitor組細(xì)胞中NF-κB p50、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照2組。上述結(jié)果表明，LPS可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，誘導(dǎo)包括TNF-α、IL-1β、IL-6在內(nèi)的炎癥因子分泌；而miR-23b可以在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。抑制miR-23b可以導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)增加。miR-23b可能在機(jī)體免疫反應(yīng)過程中起到一定調(diào)節(jié)作用，具體的機(jī)制和涉及的信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步研究。