于雁飛，王通，王廣飛，王運智，李亞，高永林

(1煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司，山東煙臺264006；2煙臺大學)

運動性疲勞主要源于肌肉疲勞和能量的衰竭，表現(xiàn)為肌肉最大收縮或者最大輸出功率暫時性下降[1]。如何延緩疲勞的發(fā)生以及促進疲勞狀態(tài)的恢復是目前研究的熱點[2]。線粒體在細胞能量代謝中發(fā)揮關鍵作用。線粒體功能障礙、結(jié)構(gòu)異常、能量代謝紊亂等都是機體產(chǎn)生運動性疲勞的潛在因素[3]。海參是一種藥用與營養(yǎng)價值極高的海洋棘皮動物，從海參中提取的海參肽具有消除疲勞、延續(xù)衰老、提高免疫力等作用[4]。2018年6～8月，我們從線粒體功能保護角度探討海參肽對運動性疲勞大鼠保護機制，旨在為海參肽的進一步開發(fā)、利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 雄性SD大鼠50只，PVC盒飼養(yǎng)，室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替時間為12 h/12 h。海參肽由煙臺嘉惠海洋生物科技有限公司提供，4 ℃干燥保存。主要試劑包括抗霉素A、細胞色素C、考馬斯亮藍、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、輔酶Q0、牛血清白蛋白等，均為Sigma公司產(chǎn)品。NaCl、NaN3、EDTA、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等均為國產(chǎn)分析純。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活因子1α(PGC-1α)、雌激素相關受體(ERR)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器包括紫外可見光分光光度計、游泳箱、電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 動物分組與干預處理 將大鼠隨機分為正常對照組、模型組及海參肽高、中、低劑量組，每組各10只。采取力竭性游泳方法進行負重游泳訓練來構(gòu)建運動性疲勞模型[5]。除正常對照組外，其他組每天進行游泳訓練，連續(xù)2周。力竭標準：動物在水中旋轉(zhuǎn)、運動協(xié)調(diào)性明顯下降，身體下沉，鼻尖淹沒至水下至再次浮出水面超過10 s。2周后分別給予海參肽高、中、低劑量組300、150、75 mg/kg海參肽灌胃，模型組和正常對照組給予等量純凈水灌胃，連續(xù)28 d。實驗結(jié)束后將大鼠麻醉處死，取股四頭肌中間部位沖洗干凈，用于后續(xù)檢測。

1.3 骨骼肌組織中MDA、SOD、GPx水平檢測 取肌肉組織剪碎，勻漿，離心取上清液。采用分光光度法檢測上清液中MDA、SOD、GPx水平，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 骨骼肌線粒體的提取 取肌肉組織1 g，剪碎。按照1∶9(w/v)加入介質(zhì)Ⅰ(0.12 mol/L KCl，20 mmol/L Hepes，5 mmol/L MgCl2，pH=7.4)勻漿，離心取上清液，用紗布過濾以去除脂肪,得到10%肌肉組織勻漿。離心取沉淀，加入介質(zhì)Ⅰ，再次離心取沉淀，加入20 mL介質(zhì)Ⅱ(0.3 mol/L Sucrose, 2.0 mmol/L Hepes, 0.1 mmol/L EDTA，2 mg/mL脫脂BSA，pH 7.4)，離心取沉淀，加入1 mL介質(zhì)Ⅱ，得到純化的線粒體。

1.5 骨骼肌線粒體通透轉(zhuǎn)運孔道(PTP)開放狀況觀察 向線粒體中加入測試溶液(230 mmol甘露醇，70 mmol蔗糖，3 mmol Hepes，pH=7.4)稀釋至0.3 mg/mL，在20 ℃的條件下進行紫外分光光度計測定。檢測線粒體在540 nm處的光密度(OD)值，以OD值表示線粒體PTP開放程度[6]，OD值降低表示骨骼肌線粒體腫脹度增加，PTP開放程度增加。

1.6 骨骼肌線粒體中呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ活性檢測[7，8]首先采用考馬斯亮藍G250法測定骨骼肌線粒體中的蛋白含量。配制0～100 μg/mL牛血清白蛋白梯度溶液(0、20、40、60、80、100 μg/mL)，分別加入5 mL考馬斯亮藍G250蛋白試劑充分混合，放置2 min后在紫外可見光分光光度計595 nm下比色，作出標準曲線。吸取線粒體提取液0.1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍G250蛋白試劑充分混合，放置2 min后595 nm下比色，記錄消光值，并通過標準曲線查得每毫升溶液中的蛋白含量，以蒸餾水作空白樣。另取酶復合物Ⅰ反應緩沖液2 mL(反應體積)，加入10 μL線粒體蛋白；然后加入輔酶Q0(80 amol/L)+BSA(1 mg/mL)、NaN3(2 mmol/L)、抗霉素(2 ag/mL)混勻，加入10 μL 200 amol/L NADH啟動反應；紫外可見光分光光度計340 nm處測定NADH吸收值(3 min內(nèi)連續(xù)測定340 nm處吸收值的變化記為ΔA，吸光系數(shù)為6.22)。取酶復合物Ⅲ反應緩沖液2 mL(反應體積)，加入10 μL線粒體蛋白；然后加入2 mmmol/L NaN3+50 amol/L細胞色素C混勻，加入10 μL輔酶Q0啟動反應；紫外可見光分光光度計550 nm處測定細胞色素C吸收值(3 min內(nèi)連續(xù)測定550 nm處吸收值的變化記為ΔA，吸光系數(shù)為21.84)。酶復合物活性=[(ΔA/min×反應體積)/吸光系數(shù)]/線粒體蛋白含量。

1.7 骨骼肌線粒體中相關蛋白PGC-1α、ERR表達檢測[9]采用Western blotting法。肌肉組織勻漿，收集上清，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取20 μL樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜，300 mA恒流1 h。加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗，室溫孵育1 h，4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜，加入二抗，室溫孵育1.5 h。TBST洗膜，加入HRP發(fā)光底物，暗室曝光。采用Image J軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組骨骼肌組織中SOD、GPx活性和MDA含量比較 見表1。與正常對照組比較，模型組肌肉組織中SOD、GPx活性降低，MDA含量升高(P<0.05或<0.01)。與模型組比較，海參肽高、中劑量組肌肉組織中SOD、GPx活性升高，MDA含量降低(P<0.05或<0.01)。

表1 各組骨骼肌組織中SOD、GPx活性和MDA含量比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各組骨骼肌線粒體PTP開放狀況比較 正常對照組、模型組和海參肽低、中、高劑量組骨骼肌線粒體OD值分別為0.48±0.09、0.10±0.01、0.08±0.02、0.24±0.04、0.39±0.06。與正常對照組比較，模型組骨骼肌線粒體OD值降低(P<0.01)；海參肽高、中劑量組較模型組升高(P均<0.01)，海參肽低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 各組骨骼肌線粒體中呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ活性比較 見表2。與正常對照組比較，模型組骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅲ活性降低(P均<0.01)。與模型組相比，海參肽高、中劑量組骨骼肌線粒體復合物Ⅰ、Ⅲ活性提高(P<0.05或<0.01)。海參肽低劑量組線粒體復合物Ⅰ、Ⅲ活性與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

表2 各組骨骼肌線粒體中呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅲ活性比較

注：與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 各組骨骼肌線粒體中PGC-1α、ERR表達比較 見表3。與正常對照組比較，模型組骨骼肌線粒體中PGC-1α、ERR表達降低(P<0.05或<0.01)。與模型組相比，海參肽高、中劑量組PGC-1α、ERR表達升高(P<0.05或<0.01)。

表3 各組骨骼肌線粒體中PGC-1α、ERR表達比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

運動性疲勞主要表現(xiàn)為能量缺失、運動耐力下、軀體性疲乏以及體力恢復時間延長[10]。運動性疲勞多由肌肉過度運動引起，可引起骨骼肌氧化應激水平的變化[11]。能量代謝機制改變是運動性疲勞發(fā)生的重要機制。線粒體在細胞能量代謝中起關鍵作用，線粒體功能障礙、結(jié)構(gòu)異常、能量代謝紊亂等均是疲勞發(fā)生的潛在因素。因此維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能的正常對緩解機體運動性疲勞具有重要意義。

海參肽具有抗氧化、抗疲勞等廣泛的生理功能，其生物利用率高，較氨基酸更易吸收[12]。盧連華等[13]報道，對小鼠給予海參肽灌胃，能夠延長小鼠負重游泳時間，降低運動后小鼠的尿血氮素和血乳酸水平，提高肝糖原含量，表明海參肽具有較強的抗疲勞作用。Ye等[14]報道，海參提取液可顯著延長小鼠的負重游泳時間和存活時間，顯著提高血紅蛋白含量并減少運動小鼠血乳酸的積累，具有顯著的抗疲勞和抗缺氧效應。王軍琦[15]報道，海參肽能夠增強小鼠單核巨噬細胞作用及體液免疫和細胞免疫功能，增強小鼠的抗疲勞能力。本研究采用力竭性游泳方法進行負重游泳訓練構(gòu)建運動性疲勞大鼠模型，通過檢測骨骼肌氧化應激指標、線粒體PTP開放程度及呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ活性和線粒體PGC-1α、ERR蛋白表達，觀察海參肽對骨骼肌線粒體功能的影響。

機體在持續(xù)運動中，體內(nèi)的氧化代謝及脂質(zhì)過氧化反應代償性增強，導致組織和血液中自由基增加并攻擊細胞及線粒體等生物膜[16]。MDA是機體內(nèi)自由基代謝的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA水平間接反映了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD和GPx作為機體內(nèi)重要的清除自由基活性酶，是緩解運動疲勞過程中氧化應激的重要保護酶。本研究結(jié)果顯示，模型組骨骼肌SOD、GPx活性降低，MDA含量升高，表明機體運動性疲勞誘導了動物體內(nèi)氧化應激反應；海參肽中、高劑量組骨骼肌SOD、GPx活性較模型組升高而MDA含量降低，說明海參肽可提高機體抗氧化能力并促進自由基清除。

線粒體PTP是位于線粒體內(nèi)、外膜之間的多蛋白復合體，可影響線粒體的正常生理功能。研究表明，疲勞引起的氧化應激可導致線粒體PTP過度開放[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組骨骼肌線粒體PTP過度開放(OD值降低)。而海參肽高、中劑量組骨骼肌線粒體PTP開放有所降低(OD值較模型組升高)。研究結(jié)果表明，海參肽可通過降低線粒體PTP開放發(fā)揮抗疲勞作用。

線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ是線粒體進行能量代謝的重要組成部件,其活性變化能直接或間接地反映線粒體呼吸功能的變化[18]。本研究結(jié)果顯示，模型組骨骼肌線粒體呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅲ活性降低，表明機體運動性疲勞引起機體線粒體呼吸功能下降。海參肽中、高劑量可顯著提高呼吸鏈酶復合物Ⅰ、Ⅲ活性。研究結(jié)果表明，海參肽可通過影響骨骼肌線粒體呼吸功能改善動物運動性疲勞狀態(tài)。

PGC-1α在調(diào)控細胞線粒體再生中發(fā)揮著重要作用。PGC-1α通過促進骨骼肌線粒體生成的轉(zhuǎn)錄因子ERR增強肌肉的抗氧化能力和抗疲勞性。PGC-1α和ERR表達反應了線粒體再生的強度。有研究表明，運動性疲勞可引起骨骼肌線粒體PGC-1α和ERR水平下降[19]。本研究結(jié)果顯示，運動性疲勞模型組骨骼肌線粒體中PGC-1α和ERR表達顯著降低。與模型組比較，海參肽中、高劑量組骨骼肌PGC-1α和ERR表達顯著增加。表明海參肽可以增加疲勞大鼠骨骼肌線粒體中PGC-1α、ERR表達，促進線粒體生成，進而增強疲勞大鼠的運動耐受力。

綜上所述，海參肽能夠?qū)惯\動性疲勞，其機制可能與其改善骨骼肌氧化應激狀態(tài)、降低骨骼肌線粒體腫脹度和線粒體膜通透性、增強骨骼肌線粒體的呼吸功能及上調(diào)線粒體生成轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α、ERR表達有關。